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EU unterstützt Ulmer Biophysiker bei Aufklärung der Chromatinstruktur

Rund drei Milliarden Basenpaare misst unsere DNA, was einer Länge von etwa zwei Metern entspricht. Damit sie im zehn Mikrometer kleinen Kern einer Säugerzelle Platz findet, muss sie um das 200.000-fache komprimiert sein. Dieser fadenartige Komplex von Erbmaterial und Proteinen heißt Chromatin. Über seine räumliche und zeitliche Anordnung in der Arbeitsphase (Interphase) der Zelle ist aber vergleichsweise wenig bekannt.

Die zugrunde liegenden Ordnungsprinzipien des Chromatins will der Ulmer Biophysiker Prof. Dr. Christof Gebhardt mit Hilfe einer neuen Mikroskopier-Methode entschlüsseln. Der Europäische Forschungsrat (ERC) unterstützt den 36-Jährigen jetzt mit 1,5 Millionen Euro zum Aufbau einer Nachwuchsgruppe in den nächsten fünf Jahren. Das Vorhaben heißt „Single Molecule Mechanisms of Spatio-Temporal Chromatin Architecture“ (ChromArch).

Neue Aufschlüsse über Prinzipien der Genregulation

Schematische Darstellung des Funktionsprinzips der RLS-Mikroskopie © C. Gebhardt

Gebhardt, seit 2013 Professor für experimentelle Physik am Ulmer Institut für Biophysik, erhofft sich mit seiner Forschung zur Chromatinstruktur neue Erkenntnisse zur Genregulation und im weiteren Sinne auch Einsichten zur Entstehung von Erbkrankheiten. Möglich macht ihm dies die Methode der RLS-Mikroskopie, die er als Postdoktorand im Labor von X. Sunney Xie an der Harvard Universität (2010 - 2013) entwickelt hat.

RLSM steht für Reflected Light Sheet Microscopy und ist eine von Gebhardt abgewandelte Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie. Die vom Frankfurter Physiker Ernst Stelzer weiterentwickelte Methode wurde von der Fachzeitschrift Nature 2014 zur Methode des Jahres gekürt. Sie geht auf die Idee zurück, nur jeweils eine Ebene des Objekts sozusagen scheibenweise zu beleuchten. Die Kamera, mit der das von den Fluoreszenzfarbstoffen ausgesandte Licht aufgenommen wird, ist senkrecht zu dieser Ebene angeordnet, womit nur mehr diejenige Schicht, die auch beobachtet wird, beleuchtet wird.

RLSM: bessere Auflösung und näher an der Physiologie

Prof. Dr. Christof Gebhardt © Uni Ulm

Xie hatte als Erster gezeigt, dass man einzelne fluoreszierende Proteine in Bakterien untersuchen kann. Gebhardt wollte nach seiner Promotion an der TU München in Harvard den Übergang von Bakterien zur um ein Vielfaches größeren humanen Zelle schaffen. Mit der Lichtblatt-Mikroskopie gelang es ihm, sehr dünne (bis zu 500 nm) Schichten der Zelle zu beleuchten und damit das Problem der Autofluoreszenz, die das gewollte Signal überdeckt, zu lösen. Da die Lichtblatt-Mikroskopie für sehr viel größere (50mal größer als eine menschliche Zelle) Organismen wie Embryonen von Zebrafischen entwickelt wurde, musste Gebhardt wegen der geringen Größe menschlicher Zellen und aus Platzgründen die Objektive koaxial anordnen und das vertikale Objektiv noch mit einem Mikrospiegel versehen, um die sterischen Einschränkungen bei senkrechter Anbringung der Objektive auszuschalten.

In Harvard gelang es ihm, die RLSM-Methode zu etablieren. Zuvor waren alternative Ansätze (konfokale Mikroskopie, Spinning-Disc-Mikroskopie, Zwei-Photonen-Anregung) zur Einzelmolekülbetrachtung mit vergleichbar hoher zeitlicher Auflösung in lebenden Zellen gescheitert. Konkret untersuchte Gebhardt die Interaktion von Transkriptionsfaktoren mit der DNA. Diese Signalproteine starten den Ausleseprozess, wenn sie sich am Genom an bestimmte Signalelemente andocken und dann der Zelle den Befehl zum Auslesen der Erbinformation geben. Mit Hilfe von RLSM weiß man jetzt, berichtet Gebhardt, dass die Zeit, die ein Transkriptionsfaktor auf der DNA sitzt, wenige Sekunden dauert. Dagegen dauert der Ausleseprozess von Genen in Säugetierzellen etwa zehn bis 30 Minuten. In Harvard ging es darum, die Bewegungen dieser Signalproteine sichtbar zu machen.

Wie ordnet die Zelle das Chromatin?

Im ERC-Projekt wird Gebhardt nun eine Methode mit Hilfe von RLSM entwickeln, um herauszufinden, wie das Chromatin im Zellkern während der Interphase angeordnet ist. Über diese Ordnungsebene des Erbmoleküls weiß die Forschung noch nicht viel. Bekanntlich ist die DNA-Doppelhelix eng gepackt, damit sie in den Zellkern passt. Im ersten Schritt wird sie um Proteine (Histone) gewunden, wodurch Nukleosomen entstehen. Diese lagern sich zu größeren spiralförmigen Strukturen (Solenoide) zusammen.

Das Chromatin ist weder starr noch unveränderlich organisiert, sondern ein dynamisches System, das nach derzeitigem Wissensstand in die komplexe Kontrolle der Genaktivität eingebunden ist. Im Arbeitszustand der Interphase, der ein paar Stunden dauert, dröseln sich die Chromosomen gewissermaßen auf und bilden sogenannte Chromosomenterritorien. Dass dort kein Chaos, sondern eine noch unbekannte Ordnung herrscht, weiß die Biologie, erklärt Gebhardt.

Wie kommt zusammen, was zusammen gehört?

Eine erste Ahnung davon haben spezielle Sequenziermethoden (Chromatin Conformation Capture) gegeben. Sie frieren die Zelle chemisch ein und ermöglichen, die Teile der Erbsubstanz zu identifizieren, die räumlich nah zusammen waren. Für dieses Verfahren benötigt man viele Zellen, erhält dadurch einen Durchschnittswert und eine ungefähre Vorstellung davon, welche Teile der DNA häufiger zusammen waren als andere. Ein Beispiel sind Enhancer- und Promotor-Sequenzen zur Regulierung der Transkription. Enhancer-Sequenzen liegen manchmal weit weg von ihren Genen auf der DNA. Durch die räumliche Faltung gelangen sie in die Nähe der übrigen regulatorischen Bindungsstellen.

Die DNA wird nur dann richtig ausgelesen, wenn die Enhancer-Sequenz zum Promotor eine räumliche Verbindung eingeht. Es muss also, folgert Gebhardt, beim Ableseprozess von vielen tausend Genen eine fein austarierte Ordnung im Chromatin-Territorium geben. Manche Bereiche müssen zusammen sein oder sich finden können, andere eher weniger. Diesen Ordnungsprinzipien in einer einzelnen humanen Zelle will Gebhardt jetzt auf die Spur kommen. Bislang sind aus Bulk-Experimenten nur sehr allgemeine Wahrscheinlichkeitsaussagen über die Anordnung im Chromatin möglich.

Wie dynamisch ist das Chromatin?

Wie beweglich das Chromatin innerhalb dieses Territoriums ist, will der Ulmer Biophysiker im Lauf des Projekts klären. Von elektronenmikroskopischen Aufnahmen weiß man, dass das Chromatin aus kompakteren (Heterochromatin) und offeneren (Euchromatin) Bereichen besteht. Im Euchromatin sind, mutmaßt Gebhardt, wahrscheinlich weit entferntere Bereiche der DNA zusammengelagert. Mit Hilfe der ERC-Förderung will er herausfinden, wie sich Heterochromatin und Euchromatin relativ zueinander bewegen.

Im Grunde will Gebhardt der Zelle ihr Geheimnis entlocken, nach welchem Ordnungsprinzip sie die DNA ordnet, wie es zu diesen Schleifen-Strukturen kommt und welche funktionelle Bedeutung diese haben. Mit seiner RLS-Mikroskopie will Christof Gebhardt die DNA sichtbar machen, sie optisch markieren, sodass man auch ihre Struktur erkennt. Starten will der Biophysiker mit humanen Zelllinien, die im Labor gut handhabbar sind, möglicherweise dann aus unterschiedlichen Gewebetypen.

Glossar

  • Bakterien sind mikroskopisch kleine, einzellige Lebewesen, die zu den Prokaryoten gehören.
  • Eine Base ist ein Bestandteil von Nukleinsäuren. Es gibt vier verschiedene Basen: Adenin, Guanin (Purinabkömmlinge), Cytosin und Thymin bzw. Uracil (Pyrimidinabkömmlinge). In der RNA ersetzt Uracil Thymin.
  • Die vier Basen liegen in der DNA-Doppelhelix immer als Paare vor. Aufgrund der chemischen Struktur ist eine Paarbildung nur zwischen A und T (DNA) bzw. A und U (RNA) sowie C und G möglich. A und T (U) sowie C und G werden deshalb auch als komplementär bezeichnet.
  • Chromosomen sind die unter dem Mikroskop sichtbaren Träger der Erbanlagen. Die Anzahl der im Zellkern vorhandenen Chromosomen ist artspezifisch. Beim Menschen sind es zweimal 23. Mit Ausnahme der Geschlechtschromosomen liegen Chromosomen in Körperzellen sowie in befruchteten Eizellen paarweise als sog. homologe Chromosomen vor. In den Keimzellen ist nach Abschluss der Reifungsteilungen nur ein einfacher Chromosomensatz vorhanden.
  • Desoxyribonukleinsäure (DNS / DNA) trägt die genetische Information. In den Chromosomen liegt sie als hochkondensiertes, fadenförmiges Molekül vor.
  • Zwei schraubenförmig umeinander gewundene DNA-Stränge bilden eine Doppelhelix.
  • Ein Gen ist ein Teil der Erbinformation, der für die Ausprägung eines Merkmals verantwortlich ist. Es handelt sich hierbei um einen Abschnitt auf der DNA, der die genetische Information zur Synthese eines Proteins oder einer funktionellen RNA (z. B. tRNA) enthält.
  • Das Genom ist die gesamte Erbsubstanz eines Organismus. Jede Zelle eines Organismus verfügt in Ihrem Zellkern über die komplette Erbinformation.
  • Für den Begriff Organismus gibt es zwei Definitionen: a) Jede biologische Einheit, die fähig ist, sich zu vermehren und selbstständig, d. h. ohne fremde Hilfe, zu existieren (Mikroorganismen, Pilze, Pflanzen, Tiere einschließlich Mensch). b) Legaldefinition aus dem Gentechnikgesetz: „Jede biologische Einheit, die fähig ist, sich zu vermehren oder genetisches Material zu übertragen.“ Diese Definition erfasst auch Viren und Viroide. Folglich fallen gentechnische Arbeiten mit diesen Partikeln unter die Bestimmungen des Gentechnikgesetzes.
  • Ein Promotor ist ein Abschnitt auf der DNA, der die Expression der dahinter liegenden Gene reguliert. Dies geschieht, indem DNA-bindende Proteine, so genannte Transkriptionsfaktoren, an den Promotor binden und so ein Startsignal für die RNA-Polymerase geben, welche eine mRNA-Kopie der Gene anfertigt.
  • Proteine (oder auch Eiweiße) sind hochmolekulare Verbindung aus Aminosäuren. Sie übernehmen vielfältige Funktionen in der Zelle und stellen mehr als 50 % der organischen Masse.
  • Nukleotidsequenzen sind Abfolgen der Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin auf der DNA (bzw. Uracil statt Thymin bei RNA).
  • Mit Transkription im biologischen Sinn ist der Vorgang der Umschreibung von DNA in RNA gemeint. Dabei wird mithilfe eines Enzyms, der RNA-Polymerase, ein einzelsträngiges RNA-Molekül nach der Vorlage der doppelsträngigen DNA synthetisiert.
  • Ein Transkriptionsfaktor ist ein Protein, dass die Herstellung einer RNA-Kopie eines Gens (Transkription) steuert. Transkriptionsfaktoren binden an bestimmte Sequenzen auf der DNA und interagieren mit der RNA-Polymerase, die dadurch ihre Transkriptionsaktivität verändert.
  • Eine Zelllinie ist eine dauerhaft etablierte Zellkultur, die sich unter definierten Bedingungen unbegrenzt vermehrt.
  • Als Fluoreszenz wird die spontane Emission von Licht bestimmter Wellenlänge nach Anregung eines Moleküls mit Licht einer anderen Wellenlänge bezeichnet.
  • Chromatin ist ein Komplex aus Proteinen und DNA, das in der Interphase der Mitose auftaucht. Es stellt die entspiralisierten Chromosomen dar.
  • Ein Nukleosom ist eine Verpackungseinheit innerhalb der Chromosomen, die aus Histonen und DNA bestehen.
  • Histone sind Eiweiße, die der geordneten Verpackung der DNA-Helix in Form von Chromosomen dienen. Dabei wird die lange DNA-Helix um die Histone herum gewunden. Diese Komplexe aus DNA und Histonen werden Nukleosomen genannt und bilden die Untereinheit der Chromosomen.
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