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Proteinaggregation: Wenn Nähe zur Gefahr wird

Verklumpen Proteine im menschlichen Körper, hat das schwerwiegende medizinische Folgen wie bei Alzheimer beispielsweise. Weniger bekannt ist, dass sich auch die biopharmazeutische Industrie mit dem biologischen Phänomen der Proteinaggregation plagt und diese unter allen Umständen zu vermeiden sucht.

In einem Forschungsvorhaben gehen Forscher der Hochschule Biberach und des Karlsruher Instituts für Technologie (KIT) das Problem der Proteinaggregation grundsätzlich an und erarbeiten daraus Lösungen. Das mit zwei Millionen Euro vom Bundesforschungsministerium komplett geförderte Vorhaben teilen sich zu gleichen Teilen das Institut für Pharmazeutische Biotechnologie und drei Institute des KIT. Es hat eine Laufzeit von drei Jahren.

Prozess der Verklumpung ist wenig untersucht

Unter Proteinaggregation fallen viele unterschiedliche, wenig bekannte und untersuchte Prozesse. Man kennt reversible und irreversible Prozesse; solche, bei denen Proteine ihre Struktur beibehalten und solche, die mit einer Ent- oder Umfaltung verbunden sind. Faltet sich ein Protein um, werden Bereiche nach außen exprimiert, die normalerweise unsichtbar sind und zu gefürchteten Immunreaktionen führen, erläutert Hans Kiefer. Der Biberacher Biochemiker und Proteinspezialist hat festgestellt, dass meist phänomenologische Lösungen herhalten müssen. Welche Form das Aggregat hat und wie es zustande kam, habe meist niemanden interessiert. Antworten auf diese grundsätzlichen Fragen sind nach seiner Überzeugung sinnvoll, weil die „jeweiligen Aggregatformen unterschiedliches Schadpotenzial haben“.

Prof. Hans Kiefer © Hochschule Biberach

Gesicherte Erkenntnis ist, dass bei Aggregation eine klare Lösung trübe wird, Proteine aus dem gelösten in den festen Zustand gehen. Entweder bilden Proteine winzig kleine Kristalle, die man selbst unter Mikroskop nicht erkennt; das bedeutet, dass Struktur und Aktivität erhalten bleiben. Oder es entsteht ein ungeordnetes Aggregat, schlimmstenfalls denaturieren die Proteine und verlieren ihre Struktur. Gewöhnlich ist dieser Zustand unumkehrbar und mit dem Verlust der Aktivität verbunden. Handelt es sich um ein pharmazeutisches Produkt, wird dieses wertlos. Im schlimmsten Fall entstehen Aggregate, die autokatalytisch wirken und weitere richtig gefaltete Proteine verklumpen.  

Im biopharmazeutischen Herstellungsprozess sind die therapeutisch genutzten Makromoleküle mannigfachen Formen von mechanischem und chemischem Stress ausgesetzt. Offensichtlich wird das bei der Aufarbeitung, dem Downstream Processing, wenn bei einem der zahlreichen Abtrennungsschritte die Proteinlösung trüb wird, sagt der Zellkulturspezialist Friedemann Hesse vom Biberacher Institut für Pharmazeutische Biotechnologie. Proteinaggregation kann aber bereits im Upstream, während der Fermentation, zum Problem werden. In der Regel, erklärt Hesse, handelt es sich um Fed-batch-Prozesse, die 14 Tage laufen. Währenddessen ist das Produkt den Kulturbedingungen mit allen möglichen Stressfaktoren ausgesetzt: Gefahren gehen aus vom Redoxpotenzial, von Laugen und Säuren zur Regulierung des pH-Wertes.

Wo und wann die Aggregation auftreten kann, hängt auch von den Proteinen ab, sagt Kiefer. Im Allgemeinen aber fördert das Biomanufacturing eher die Verklumpung. Will man monoklonale Antikörper beispielsweise stabil als Lösung lagern, würde man niedrige Temperaturen wählen (Null Grad Celsius, pH 5 statt pH 7, weil damit die Proteine stärker geladen sind und sich abstoßen), wenn es denn die Zellkultur zuließe. Denn dort ist der Hersteller gezwungen, bei 37 Grad Celsius und neutralem pH-Wert 7 zu arbeiten.  

Frühe Detektion in der Kulturbrühe

Prof. Friedemann Hesse. © Pytlik

Welche Faktoren oder Prozessführungsparameter schon in der Kulturbrühe zur Proteinaggregation führen, will die Gruppe um den Zellkulturspezialisten Friedemann Hesse klären. Sie will diese mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen messen. Aus der Literatur weiß man, dass sich bestimmte Fluoreszenz-Farbstoffe an bestimmte Aggregate anlagern oder in solche eingelagert werden und damit ihr Signal ändern, was eine Fluoreszenz-Sonde detektieren könnte. Dies im Kulturverlauf am Modellprotein Antikörper umzusetzen, ist Ziel von Hesses AG.

Gelingt mit dem Fluoreszenzspektrometer der spezifische Verklumpungsnachweis, soll mit geänderten Prozessparametern versucht werden, die Aggregation zu beeinflussen. Das wären erste Schritte hin zum Verständnis der Mechanismen, die der Verklumpung zugrunde liegen. Hesses Arbeiten haben grundlegenden Charakter, weil sie klären müssen, wie die Zellen das Fluoreszenzsignal beeinflussen, sich mit diesen Farbstoffen vertragen und welche Fluoreszenzfarbstoffe prozesstauglich sind.   

Meist wird erst in der Aufreinigung versucht, diese Proteinklumpen abzutrennen. Im Downstream ist das Problem schon länger bekannt und besser untersucht. Hier versuchen die Hersteller die Bedingungen des Chromatographie-Schritts zum Beispiel durch Absenkung der Proteinkonzentration zu beeinflussen. Extrem hohe Proteinkonzentrationen tauchen auch punktuell bei chromatografischen Elutions-Schritten auf, die man durch flachere Gradienten zu vermeiden sucht. Auch durch Ultrafiltration ist es möglich, ein monomeres Protein von größeren (z. B. bereits dimeren) Aggregaten abzutrennen.

Osmolyte als mögliche Aggregationshemmer

Mit optimierten pH-Werten, Salzbedingungen und Zugabe stabilisierender Substanzen versuchen die Hersteller der Verklumpung ihrer wertvollen Moleküle vorzubeugen. Diese zur Lagerung der Wirkstoffe bereits verwendeten Substanzen (Osmolyte) fand man eher zufällig in Organismen, die sich vor Proteinaggregation in der Zelle schützen, indem sie bestimmte proteinstabilisierende Stoffe herstellen, berichtet Hans Kiefer.

Seine Arbeitsgruppe verfolgt zwei Ziele. Zum einen soll in getrennten Modellsystemen - je zur Hälfte mit Allerweltproteinen und pharmazeutisch wichtigen Proteinen - kontrollierte Aggregation hervorgerufen und die dafür nötige Analytik entwickelt werden. Bei zwei Proteinen gelang bereits die gezielte Fibrillenbildung. Auch andere Mechanismen wie die amorphe Präzipitation (aggregierende Festkörperpartikel ohne bestimmte Struktur), will Kiefers AG kontrolliert herbeiführen. Durch die große Bandbreite ausgewählter Proteine soll sichergestellt werden, dass die Aggregationsmechanismen im Grundsatz verstanden werden. Gelingt dies, sollen Osmolyte zugesetzt werden, um deren aggregationsverhindernden Einfluss auf molekularer Ebene zu klären. Erste Arbeiten zu diesen natürlichen Substanzen wurden bereits durchgeführt, eine Publikation bereitet der Biberacher Proteinfachmann gerade vor. Seine Arbeitsgruppe arbeitet mit 30 unterschiedlichen Osmolyten, die zu den Substanzklassen Zuckermoleküle (Polyalkohole), Aminosäuren und Methylamine gehören.

Osmolyte kommen in Bakterien, aber auch in höheren Organismen wie dem Stamm der Bärtierchen vor. Diese Überlebenskünstler sind vor Austrocknung, hohen wie tiefen Temperaturen und sogar kosmischer Strahlung geschützt. Bekannt ist, dass sie einen Zucker namens Trehalose produzieren, der wie ein natürliches Frostschutzmittel wirkt. Die achtbeinigen Organismen produzieren aber auch andere Substanzen: „Vielleicht kommt es auf die richtige Mischung an“, formuliert Kiefer eine Art Hypothese.
Zuerst will Kiefers Gruppe die Wirkweise dieser Schutz-Substanzen und ihr jeweiliges Antiverklumpungspotenzial untersuchen, ehe eine chemo-informatische Analyse der Aggregationsinhibierung Eigenschaften zurechnen soll. Bei Erfolg denkt Hans Kiefer an neue Moleküle mit verbesserter Wirkung, an neue Zusatzstoffe für die Industrie.

Kristallisation, hier von Insulin, ist auch eine Form von Aggregation, allerdings reversibel. © Lilly Pharma

Diese neuen Aggregationshemmer könnte man bereits dem Kulturmedium zusetzen und testen, sagt Friedemann Hesse. Bislang aber ist ihr Einsatz schwierig, weil sie ihr Hemmungspotenzial nur bei hohen Konzentrationen (bis zu 20 Prozent vom Lösungsmittel) ausspielen, was wiederum die Zellkultur beeinflusst. Obendrein benötigt man davon große Mengen, was hohe Kosten verursacht. Deshalb wäre es attraktiv, effektivere Substanzen zu haben, die bereits in niedrigerer Konzentration wirken.

Über den molekularen Ablauf der Proteinaggregation im biopharmazeutischen Prozess liegen wenige Erkenntnisse vor. Vermutlich reicht das alleinige Aneinanderstoßen der Moleküle nicht aus, sondern diese müssen zumindest kurzfristig ihre dreidimensionale Struktur verlieren, sich teilweise öffnen. Dieser Vorgang ist nach Kiefers Worten mehr oder weniger allen löslichen Proteinen eigen. Doch auch der gefaltete Zustand ist kein statischer Zustand; Experimente und Computersimulationen haben belegt, dass sich Proteinmoleküle sehr stark bewegen. Zeigen Proteine kurzfristig normalerweise im Innern verborgene Aminosäuren, kann das eine irreversible Aggregation, eine dauerhafte Umfaltung auslösen. Wenn diese nach außen gelangten hydrophoben Bereiche des Makromoleküls auf ein ebenso „extrovertiertes" Nachbarprotein stoßen, können sich diese Proteine sehr leicht aneinanderlagern, versucht Kiefer eine Erklärung.

Anders verhält es sich bei (Mikro-)Kristallen oder amorphen Aggregaten, bei denen sich die Proteine nicht entfalten, sondern nur über ihre normale Oberfläche zueinander in Kontakt treten, ohne ihre Struktur zu verlieren. In diesem Fall handelt es sich um reversible Aggregation, die in der Regel dann vorliegt, wenn die Lösungsmittelbedingungen so geändert werden, dass die Proteine nicht mehr löslich sind. Dieser Vorgang ist relativ gut verstanden.  

An drei KIT-Instituten werden Biberacher Analysen weiterentwickelt

An drei Instituten des KIT sollen die in Biberach erarbeiteten Analysemethoden weiterentwickelt werden. Jürgen Hubbuch vom Institut für molekulare Aufarbeitung von Bioprodukten untersucht zwei Schritte in der Aufreinigung, wo die Proteinaggreation besonders schwer wiegt: bei der Aufkonzentrierung über Ultrafiltration und bei der hydrophoben Chromatografie. Seine Arbeitsgruppe will klären, wann sich die Verklumpungen bilden und wie sich diese bestmöglich verringern lassen.

KIT- Arbeitsgruppen um den Kristallisationsexperten Matthias Kind (Institut für thermische Verfahrenstechnik) und den Fachmann für Fest-Flüssig-Trennung Hermann Nirschl vom Institut für mechanische Verfahrenstechnik wollen in ihren Projekten die gezielte Präzipitation/Aggregation herbeiführen, und zwar ohne Aktivitätsverlust, und diese als Reinigungsschritt etablieren, ähnlich wie es in einem Verbundprojekt zur Kristallisation geschieht, an dem auch der Biberacher Hans Kiefer mitwirkt.

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