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Hans-Jürgen Apell - Dem aktiven Ionentransport auf der Spur

Der Biophysiker Prof. Hans-Jürgen Apell betreibt an der Universität Konstanz Grundlagenforschung zur Aufklärung molekularer Vorgänge beim Ionentransport durch Membranen und liefert wichtige Erkenntnisse für neue therapeutische Konzepte. Sein hauptsächliches Forschungsgebiet dabei sind Struktur-Funktions-Beziehungen bei P-Typ-ATPasen, die als ATP (Adenosintriphosphat) spaltende Enzyme Ionentransport bewirken und dadurch unter anderem die Bewegung von Muskelfasern sowie verschiedene Reaktionen des Energiestoffwechsels ermöglichen oder Target bei der Entwicklung für Wirkstoffe wie Herzinsuffizienz sind.

Prof. Dr. Hans-Jürgen Apell (Foto: A.Fibich)
Eine unangenehme Erfahrung, die die meisten Menschen schon gemacht haben und deren Ursache in einer P-Typ-ATPase liegt, sind Muskelkrämpfe. Die Muskeln kontrahieren, d.h. sie spannen sich an und bleiben in diesem Zustand, bis es weh tut. Der Grund dafür liegt in der Regel darin, dass die Ca-ATPase in den Muskelzellen nicht richtig arbeiten kann, weil zu wenig Magnesium-Ionen vorhanden sind und die ATP-Moleküle, die der „Treibstoff“ für die Ca-ATPase sind, nur in Verbindung mit Magnesium-Ionen wirksam sind. Dies bedeutet, das nur wenn die Ca-ATPase funktioniert, sie Calcium-Ionen in die Speicher der Zellen zurückpumpt und sich die Muskeln entspannen.

ATPasen kommen in allen Lebewesen vor und sind Proteine, die das ATP in ADP (Adenosindiphosphat) und Phosphat aufspalten, wobei Energie freigesetzt wird, welche vom Enzym genutzt werden kann, um andere Reaktionen anzutreiben. So liefern ATPasen beispielsweise auch die Energie, die für die Signaltransduktion notwendig ist. Manche der als „Ionenpumpen“ bezeichneten ATPasen sind Membranproteine, die für einen Ionentransport zwischen verschiedenen Zellkompartimenten beziehungsweise zwischen der Zelle und dem extrazellulärem Raum sorgen. Sind Membranproteine in ihrer Funktion behindert, kann das zu schweren Stoffwechselstörungen oder zum Verlust der Organfunktion führen. Zellen können ohne ATPasen nicht leben, da diese als aktive Ionentransporter thermodynamische Ungleichgewichtszustände aufrecht erhalten und eine Zelle tot ist, sobald sie sich im Gleichgewicht befindet.

Keine lebenden Zellen ohne funktionierende ATPasen

Eine der Untergruppen der ATPasen, die im Fokus der Forschung von Professor Apell stehen, sind die sogenannten P-Typ-ATPasen. Bei der Reaktion mit ATP wird diese Klasse von ATPasen vorübergehend phosphoryliert. Neben der Ca-ATPase in den Muskelzellen, die für die Entspannung der Muskelfasern sorgen, gehören die Na-K-ATPase und H-K-ATPase zur Familie der P-Typ-ATPasen. Die Na-K-ATPase kommt in allen tierischen Zellen vor und ist ein absolut lebensnotwendiges Enzym. Wird die Na-K-ATPase vergiftet, stirbt eine Zelle innerhalb kurzer Zeit ab. Deshalb gibt es in der „freien Wildbahn“ auch einige Toxine, durch die die Na-K-ATPase blockiert wird, um Beutetiere lähmen bzw. töten zu können oder um sich vor Fressfeinden zu schützen. Das Toxin Digitalis im Fingerhut zum Beispiel ist ein Blocker der Na-K-ATPase. Die gastrische H-K-ATPase wiederum kommt in speziellen Zellen der Magenschleimhaut vor und ist für die Sekretion von Salzsäure verantwortlich, indem sie H+-Ionen (Protonen) in den Magen pumpt. Um bei Erkrankungen der Magenschleimhaut oder bei Magengeschwüren die Säureproduktion zu reduzieren, wird gezielt die H-K-ATPase blockiert.

Die Arbeit der Arbeitsgruppe von Hans-Jürgen Apell besteht darin, Erkenntnisse über den molekularen Mechanismus des aktiven Ionentransports durch Zellmembranen mittels P-Typ-ATPasen zu gewinnen, die beispielsweise auch zur Entwicklung von neuen oder effektiveren Hemmstoffen bei Magensäuresekretion beitragen können. „Die von uns verwendeten Methoden erlauben unter anderem die Einführung von Assays, mit denen die Wirkung von beliebigen Pharmaka auf P-Typ-ATPasen einfach getestet werden können“, sagt Hans-Jürgen Apell. Um dieses Ziel zu erreichen, geht es dem Forscher und seinem Team in erster Linie darum, den Ionenpumpvorgang der P-Typ-ATPasen im Detail aufzuklären. Einige grundlegende Prinzipien sind bereits bekannt.
Hans-Jürgen Apell studierte an der Universität Marburg Physik. Nach dem Diplom 1974 im Bereich Kernphysik mit einer experimentellen Arbeit, die am Niels-Bohr-Institut in Kopenhagen durchgeführt wurde, promovierte er in Biophysik an der Universität Konstanz über den Mechanismus der Ionenkanalbildung des Antibiotikums Gramicidin (1978). Im Jahre 1989 habilitierte der Biophysiker über Mechanismen des elektrogenen Ionentransport in biologischen Membranen an der Universität Konstanz. Dort vertrat er von 1991 bis 1995 den Lehrstuhl für Biophysik und ist seitdem Leiter der Arbeitsgruppe Biophysik/Membranbiologie.

Experimente mit tierischen Membranpräparaten

„Der Transport durch die Na-K-ATPase läuft im „Pingpong-Modus“ ab: Erst werden in den Ionenbindestellen die Natrium-Ionen aus dem Zellinneren gebunden, transportiert und auf der anderen Membranseite freigesetzt, dann binden die Kalium-Ionen in den gleichen Bindestellen von außen und werden in die Zelle transportiert“, beschreibt Hans-Jürgen Apell den Prozess. Vergleichbare Pumpmechanismen habe man ihm zufolge auch bei der Ca-ATPase und der H-K-ATPase gefunden. Um den zyklischen Ablauf und Pingpong-Modus im Einzelnen aufzuklären, sind sowohl strukturelle als auch kinetische Experimente nötig. „Es ist faszinierend, mit welcher Präzision und Geschwindigkeit diese Ionenpumpen, die aus nur ungefähr 1.000 Aminosäuren bestehen, ihre Aufgabe erfüllen. Wie dies möglich ist und welche molekularen Vorgänge dabei stattfinden, möchten wir gerne verstehen", so Hans-Jürgen Apell.

Im Zentrum der Forschungstätigkeit von Professor Apell steht die Untersuchung an Membranen, die aus tierischen Zellen gewonnen werden. „Wir arbeiten mit Membranpräparaten aus Kaninchennieren (für die Na-K-ATPase), aus Kaninchenmuskeln (für die Ca-ATPase) und aus dem Magen vom Schwein (für die H-K-ATPase)“, sagt der Biophysiker. Die darin enthaltenen ATPasen unterscheiden sich nur in wenigen Aminosäuren von den menschlichen Isoformen, so dass keine signifikanten Unterschiede zwischen den tierischen und menschlichen Formen der Proteine zu erwarten sind und bei zahlreichen Vergleichen in anderen Labors bisher nicht festgestellt wurden.
Anhand elektrophysiologischer Methoden untersucht Prof. Hans-Jürgen Apell Ionenbewegungen. (Foto: A.Fibich)

Optische Verfahren zur Entschlüsselung des Pumpmechanismus

Die experimentellen Untersuchungen des Konstanzer Forschers zum Mechanismus der Ionenpumpen konzentrieren sich im Wesentlichen auf optische Verfahren. Mithilfe von sogenannten elektrochromen Fluoreszenzfarbstoffen wird bei extrem hoher Zeitauflösung (bis in den Mikrosekundenbereich) die Bewegung von Ionen in den Ionenpumpen verfolgt. Dabei werden funktionell aktive, reine Präparationen der drei P-Typ-ATPasen verwendet. Mit kommerziell verfügbaren oder selbst konstruierten Fluoreszenzspektrometern und -messständen wird das Verhalten der Ionenpumpen bei Veränderung der Ionen- oder ATP-Konzentrationen untersucht. „Die gemessenen Fluoreszenzänderungen werden von uns ausgewertet und lassen weitreichende Schlüsse auf Ionenbewegungen in den Ionenpumpen zu“, berichtet Hans-Jürgen Apell.

Mit diesem Verfahren konnten bereits eine ganze Reihe von Erkenntnissen gewonnen werden, die sich bisher den elektrophysiologischen Untersuchungsmethoden entzogen haben. So ermöglicht die angewandte Fluoreszenzmethode die Messung von Ladungsbewegungen, die sehr langsam sind oder nur kurze Strecken in der Membran erfolgen und aufgrund eines kleinen Signal-Rausch-Verhältnisses nicht mehr aufgelöst werden können. Das Fluoreszenzsignal nach Erreichen eines neuen Bindungszustands ist ein stabiles Signal, das leicht und genau gemessen werden kann, während die Stromsignale transienter Natur sind. Durch dieses Verfahren wurde insbesondere die Na-Bindung auf der zytoplasmatischen Seite der Na-K-ATPase aufgeklärt, was elektrophysiologisch nicht möglich war. Auch bei der H-K-ATPase konnte zum ersten Mal bestimmt werden, welche Teilreaktionen mit Ladungsbewegungen verbunden sind und welche nicht.

Wie der Biophysiker erzählt, kommt auch die mathematische Modellierung der experimentellen Daten zum Einsatz, die mit verschiedenen mechanistischen Ansätzen wohldefinierte Randbedingungen für theoretische Modellbeschreibungen der P-Typ-ATPasen liefert und in Zukunft dazu führen soll, dass ein genereller Pumpmechanismus der P-Typ-ATPasen erkennbar wird und formuliert werden kann. Bei der Erforschung von ATPasen bestehen intensive Kollaborationen mit Arbeitsgruppen in Australien, Israel, Russland und den USA, mit denen gemeinsam an den Fragestellungen mit den dort etablierten Methoden gearbeitet wird. Durch diese synergistische Arbeitsweise können beträchtliche Summen für die oft komplexen Versuchsaufbauten eingespart werden.

Eine wichtige Rolle bei der Erkenntnisgewinnung spielen auch die am Computer erstellten 3D-Strukturen von Proteinen in atomarer Auflösung. „Diese Mittel helfen uns, eine räumliche Vorstellung zu erhalten, wie verschiedene (funktionale) Teile oder Domänen des Proteins in Beziehung stehen, z.B. wo sich die Ionenbindungsstellen befinden, wo der Zugangsweg zu diesen sein könnte oder an welcher Stelle ein Toxin binden und das Protein blockieren oder modifizieren könnte. "

Aufdeckung von Prinzipien für die medizinische und pharmakologische Forschung

Die in der Arbeitsgruppe von Apell gewonnenen, hochreinen Proteinpräparationen sind auch für diverse Untersuchungen in der pharmazeutischen Forschung von Interesse. „So können die eingeführten Messmethoden zur Aufklärung von Wechselwirkungen zwischen pharmakologisch aktiven Substanzen und den P-Typ-ATPasen eingesetzt werden, sowohl um Effekte der Substanzen überhaupt zu identifizieren, als auch um den Wechselwirkungsmechanismus aufzuklären. In diesem Zusammenhang gab es in der Vergangenheit bereits Kooperationen z.B. mit der Firma Altana Pharma (heute Nycomed) in Konstanz. Dabei ging es im Wesentlichen um die Wechselwirkung des von Altana vertriebenen H-K-ATPase-Blockers Pantoprazol auf die Na-K-ATPase“, berichtet Hans-Jürgen Apell.

Auf die Frage nach den kommenden Forschungszielen erzählt der Membranbiologe, dass man in Zusammenarbeit mit Kollegen aus Israel, denen es gelungen ist, die Na-K-ATPase in Hefezellen zu exprimieren, beabsichtigt, die Unterschiede zwischen verschiedenen Isoformen der Na-K-ATPase zu bestimmen und deren molekulare Ursachen aufzuklären. „Diese grundlegenden Erkenntnisse sind für die pharmakologische Forschung mit Sicherheit interessant, da schon seit langem neue Wirkstoffe gegen Herzinsuffizienz gesucht werden, bei denen ein primäres Target die Na-K-ATPase ist.“

Ein weiteres wesentliches Ziel der Arbeitsgruppe von Professor Apell ist die Erforschung des molekularen Mechanismus, durch den die chemische Energie, die durch die Hydrolyse von ATP zur Verfügung gestellt wird, in „Transportenergie“ umgewandelt wird. „Für diesen Mechanismus gibt es bisher noch kein ausgereiftes Konzept, er ist aber außerordentlich interessant, da der Wirkungsgrad je nach ATPase zwischen 60 und 90 Prozent liegt und eine Ausbeute darstellt, die bei makroskopischen Maschinen undenkbar ist.

mst – 06.11.08
© BIOPRO Baden-Württemberg GmbH

Weitere Informationen zum Beitrag:
Prof. Dr. Hans-Jürgen Apell
Universität Konstanz
Fachbereich Biologie
Arbeitsgruppe Membranbiophysik
Tel.: +49 (0)7531 88-2253
E-Mail: h-j.apell@uni-konstanz.de




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