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CRISPR-Cas ist wohl für weitere Überraschungen gut

Seit 2012 untersucht die DFG-Forschergruppe FOR1680 das CRISPR-Cas genannte Immunsystem von Bakterien und Archaeen, womit sich die Einzeller gegen Angriffe von Viren und fremdem Erbgut wie Plasmiden zur Wehr setzen. Dass sich Prokaryoten feindliche Erbsubstanz wie bei einer Selbstimpfung einverleiben und diesen Schutz sogar vererben, hat Forscher wie die Ulmer Molekularbiologin Prof. Dr. Anita Marchfelder, Koordinatorin von FOR1680, von Anfang an überrascht. Allem Anschein nach kann das Abwehrsystem sogar noch mehr: „In den letzten Jahren hat sich immer mehr gezeigt, dass das CRISPR-Cas-System auch andere Funktionen hat.“ Damit soll sich hoffentlich ein DFG-Schwerpunkt in naher Zukunft beschäftigen.

Prof. Dr. Anita Marchfelder, Sprecherin und Koordinatorin der DFG-Forschergruppe FOR1680. © Elvira Eberhardt, Universität Ulm

2007 erstmals beschrieben, begeisterte der molekulare Mechanismus von CRISPR-Cas Marchfelder und Kollegen. Binnen weniger Jahre ist CRISPR-Cas dem Stadium der Grundlagenforschung in selten gekannter Windeseile entwachsen, gilt als bahnbrechendes molekulares Prinzip, das längst Einzug in die Genlabore der Forschung gehalten hat. Die Fachzeitschrift Science rief 2013 sogar einen „CRISPR-Craze“ aus und nutzte für das Genome-Editing 2015 das Label „Breakthrough of the Year“. Nicht die Fähigkeit von Einzellern, sich fremde Erbmoleküle einzuverleiben, sich zu impfen und vor weiteren Attacken zu schützen, macht seither Furore. Es ist vor allem die Fähigkeit des mit CRISPR verbundenen Cas9-Proteins, zusammen mit der „single guide“ RNA (sgRNA) DNA sequenzspezifisch zu erkennen und zu zerschneiden. Als präzises wie schnelles genomchirurgisches Werkzeug hält es nach Meinung vieler Wissenschaftler ein Füllhorn von praktischen Anwendungen bereit, von der industriellen Biotechnologie über Pflanzen- und Tierzucht bis zur Heilung genetisch bedingter Krankheiten.

FOR1680 hat seit 2012 maßgeblich zum grundlegenden Verständnis von CRISPR-Cas beigetragen. Die Gruppe hat CRISPR-Varianten verschiedener Bakterien und Archaeen miteinander verglichen. Je mehr Abwehrsysteme sie untersuchten, desto mehr natürliche Varianten entdeckten sie. Bis Ende 2017 wird FOR1680 nach einer positiven Zwischenevaluierung weiter gefördert.

Das CRISPR-Cas-System ist noch lange nicht verstanden

Bei den Untersuchungen werden molekularbiologische, genetische und biochemische Methoden eingesetzt. Die sieben Teilgruppen mit den Schwerpunkten Mikrobiologie, Bioinformatik, Strukturbiologie und Massenspektrometrie arbeiten mit vier assoziierten Gruppen eng zusammen. Angesichts des publizistisch befeuerten Hypes um CRISPR-Cas gerät ins Hintertreffen, dass der rasche Fortschritt aber auch seine Tücken hat. "Keiner hat Zeit, das System erst einmal ganz basal zu charakterisieren", kritisiert Bo Huang, der als Biophysiker an der University of California in San Francisco arbeitet. "Solange alles funktioniert, interessiert es keinen, wie und warum." 1

Genau das tut FOR1680. Man könne diese Genschere erst dann optimieren, wenn man wisse, wie die crRNA – einer der wichtigen Bestandteile für das Gene Editing mit CRISPR-Cas9 – ihr Target erkennt und mit diesem interagiert. Zusätzlich müsse man wissen, wie die Schere an die richtige Stelle im Genom geführt wird, um zu schneiden. Erst dann lasse sich verhindern, dass sie an unerwünschten Stellen im Genom bindet und schneidet. So unaufgeregt wie wichtig hören sich Bedenken von Grundlagenforschern zum Thema "off-targeting" an.

Das CRISPR-Cas-System in Einzellern hat einige hochkonservierte Bestandteile, scheint aber auch viele Varianten zu besitzen. Die Cas-Proteine, deren berühmtestes Cas9 ist, gehören zu den 93 Proteinfamilien, die bisher bekannt sind. Deren funktionelle Bestimmung steht nach Marchfelders Worten in vielen Fällen noch aus. Zahlreiche Fragen zu Struktur und Funktion der Hauptbestandteile von CRISPR seien nach wie vor offen.

Neue Klassifikation der 4.000 bekannten CRISPR-Cas-Loci

Anfangs konzentrierte sich die internationale Forschergemeinde hauptsächlich auf das E.-coli-System, das nach heutiger Klassifikation zum Typ I-E gehört. FOR1680 indes machte es sich zur Aufgabe, auch andere Systeme zu untersuchen. Zusammen mit den Freiburger Bioinformatikern um Rolf Backofen und internationalen Forschern gelang es 2015, mehr als 4.000 bekannte CRISPR-Abwehrsysteme von Bakterien und Archaeen zu klassifizieren. Die Forscher unterteilten die CRISPR-Cas-Systeme in zwei Klassen, fünf Typen und 16 Subtypen. Die neueste Studie schlägt vor, die Abwehrsysteme stattdessen in zwei Klassen mit sechs Typen einzuteilen, die sich wiederum in 19 Subtypen gliedern.2 Die jüngsten Ergebnisse betonen das ausgeprägte Baukastenprinzip und die Dynamik der Evolution der CRISPR-Cas-Systeme. Allein von den Cas-Proteinen seien mittlerweile 359 bekannt, die zu Proteinfamilien gehören, deren Sequenzen so unterschiedlich seien, dass sich daraus kaum ähnliche Funktionen ableiten lassen.

Auch das Genome Editing ist in den Blickpunkt der Forschergruppe gerückt, seitdem FOR1680 um die Cas9-Pionierin Prof. Dr. Emmanuelle Charpentier erweitert wurde. Sie entdeckte 2015 das Cpf1-Protein, das inzwischen als besserer Nachfolger von Cas9 gehandelt wird, weil es kürzer ist und anders als Cas9 nur eine statt zwei RNAs benötigt.

CRISPR-Cas ist sehr unterschiedlich verteilt

Inzwischen hat FOR1680 weitere grundlegende Erkenntnisse zu CRISPR gewonnen. Allgemein, so Marchfelder, findet es sich in etwa 50 Prozent aller untersuchten Bakterien. Noch höher ist die Rate in Archaeen, wo es in neun von zehn Archaeen gefunden wurde. Über die Gründe dieser unterschiedlichen Verteilung diskutiert die Forschergemeinde lebhaft. Aus Sicht der Evolution ist es vor allem für pathogene Organismen vorteilhaft, fremde DNA aufzunehmen. Nimmt allerdings ein Bakterium immer wieder fremdes Erbgut in sich auf, wird es immer größer, was seine „Fitness“ beeinträchtigen könnte.

Autoimmunkrankheit bei Bakterien?

Die Forschergruppe hat erstaunliche Funde zutage gefördert, die Gegenstand spannender Diskussionen sind. Bioinformatische Analysen führten zu einem eigentümlichen Ergebnis. So kann sich ein Teil des „fremden Steckbriefs“ auch gegen das eigene Genom richten. Während dies für Bakterien meist den Tod bedeutet, treten bei Archaeen in diesen Fällen eigene Reparatursysteme in Kraft. „Einen Steckbrief gegen sich selbst zu bekommen, kann relativ schnell passieren“, erklärt Archaeen-Spezialistin Anita Marchfelder. Das CRISPR-Cas-System könnte also die Gefahr bergen, dass es Steckbriefe gegen den Organismus einbaut, was für Bakterien meist Selbstmord bedeutet. Für Archaeen sei dies nicht nur nicht schädlich, sondern markiere möglicherweise einen Schritt hin zur Genregulation. Bioinformatische Ansätze gewinnen in diesem Forschungsfeld immer größere Bedeutung, weil man alle fremden Sequenzen untersucht und möglicherweise auf bislang unbekannte virale Genome stößt. Damit nicht genug: Halophile Archaeen, so Marchfelder, können sich in ihrer ökologischen Nische mit ihren Steckbriefen gegenseitig bekämpfen, manchmal fusionieren sie, tauschen DNA aus und verfügen über Spacer – also Überbleibsel von Viren und Plasmiden – gegen das Erbgut anderer Archaeen. Über die Ursache dafür können die Wissenschaftler momentan nur spekulieren.

Proteinkomplex muss noch weitere Funktionen in Einzellern haben

CRISPR-Cas gibt es in vielen Varianten. In Archaeen findet sich die bekannteste Variante CRISPR-Cas9 nicht, wohl aber vermehrt in pathogenen Bakterien. Dies legt eine Korrelation von Cas9 mit der Virulenz nahe, so die FOR1680-Koordinatorin Marchfelder. In manchen Fällen gibt es sogar verschiedene Versionen des Abwehrsystems in einem Organismus. Die Anwesenheit von drei gleich effektiven Abwehrsystemen in einem Organismus hat die Forscher zur These geführt, dass CRISPR-Cas noch andere zelluläre Funktionen besitzen müsse.

Das CRISPR-Cas-System lässt sich aufgrund seiner Vielfalt nicht auf allgemeine molekulare Mechanismen herunterbrechen. In neun von zehn Fällen werde DNA geschnitten. Aber schon der genaue Ablauf sei sehr unterschiedlich, wie auch die daran beteiligten Proteine. Allein das Cas1-Protein sei in allen untersuchten Organismen gefunden worden, das als essenziell für die Anpassung an neue Angreifer gilt. Die anderen Cas-Proteine unterscheiden sich nach Marchfelders Worten in hohem Maße voneinander. Von den genschneidenden Nukleasen wie Cas9 kennt die Forschung nur einen kleinen Prozentsatz. Weitere Überraschungen wie die Entdeckung des Cpf1-Proteins hält Marchfelder nicht für ausgeschlossen.

„In den letzten Jahren hat sich immer mehr gezeigt, dass das CRISPR-Cas-System auch andere Funktionen hat.“ Bei pathogenen Organismen ist das Cas9-Protein in Virulenz-Regulation und -Reaktion involviert. Auch bei der Biofilm-Bildung hat man Bezüge zum CRISPR-Cas-System gesehen, desgleichen bei der DNA-Reparatur. Manchmal finden sich nur Teile des Proteinkomplexes wie die bloße CRISPR-RNA in einem Organismus. Auch die gegen Prokaryonten selbst gerichtete Abwehr soll der neue DFG-Schwerpunkt erforschen und damit weitere Erkenntnisse zur Funktionsvielfalt von CRISPR-Cas liefern.

1 Heidi Ledford, Gentechnik: CRISPR verändert alles, in: Spektrum der Wissenschaft, 24.06.2015

Mohanraju, P.; Makarova, K. S. et al.: Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems, Science, 05.08.2016, DOI: 10.1126/science.aad5147

Literatur:

Hrle, A.; Su, A. AH, Structure and RNA-binding properties oft he Type III-A CRISPR-associated protein Csm3, RNA Biology 10 (11), 1670-1678, Nov. 2013, DOI: 10.4161/rna.26500

Hrle, A. Meier, L-K, et al.: Structural analyses oft he CRISPR protein Csc2 reveal the RNA-binding interface oft he type I-D Cas7 family, RNA Biology 11 (8), 1072-1082, August 2014, DOI: 10.4161/rna.29893

Makarova, K. S.; Wolf, Y.I. et al.: An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems, Nature Reviews Microbiology, 28.9.2015, DOI: 10.1038/nrmicro3569

 

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