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Diagnostik multiresistenter Erreger - Viele Wege führen zum Ergebnis

Antibiotikaresistente Bakterien stellen eine zunehmende Herausforderung für die moderne Medizin dar. Um infizierte Patienten erfolgreich behandeln zu können, ist nicht nur eine klare Diagnose vorhandener Erreger, sondern auch eventuell auftretender Resistenzen nötig. Diese Diagnostik stellt Mikrobiologen in medizinischen Laboren vor große Herausforderungen, wie Dr. Oliver Nolte vom Labor Dr. Brunner in Konstanz berichtet. Denn Test, die gleichzeitig schnell und zuverlässig sind, gibt es nur in den wenigsten Fällen.

In der Bekämpfung antibiotikaresistenter Erreger kann die richtige Therapie über den Heilungsverlauf oder sogar über Leben und Tod von Patienten entscheiden. Durch Verzögerungen in der Erkennung der Resistenzen und dadurch bei der Einleitung geeigneter Maßnahmen führte beispielsweise ein Ausbruch von besonders hartnäckigen multiresistenten Keimen, sogenannten Carbapenemase-Bildnern, 2010 in einer Klinik in Holland zu mehreren Todesopfern. Die besondere Schwierigkeit lag in diesem Fall darin, dass sich diese Art der Resistenz in vitro nicht immer eindeutig zeigt, auch wenn sie klinisch eine Rolle spielt. Nur durch Zusatztests ist es dann möglich, einen mutmaßlichen oder verborgenen Resistenzmechanismus zu verifizieren. Diese Aufgabe kommt den medizinischen Laboren zu, deren Mikrobiologen die Erreger identifizieren und vorhandene Resistenzen sicher nachweisen müssen.

Klassische Resistenzbestimmung ist zeitaufwendig

An erster Stelle bei der Resistenzbestimmung im Labor stehen klassischerweise die Isolation der Bakterien aus dem Probenmaterial und die Anzucht einer Reinkultur, die die Grundvoraussetzung für weitere Untersuchungen darstellt. „Dieses Prinzip geht noch auf Robert Koch und die prä-antibiotische Ära zurück und kostet viel Zeit, im Regelfall mindestens 18 bis 24 Stunden, unter Umständen auch deutlich länger“, erklärt Dr. Oliver Nolte, Leiter der Molekular- und Mikrobiologie im Medizinischen Labor Dr. Brunner in Konstanz. Die Reinkulturen werden dann auf Empfindlichkeit bzw. Resistenz getestet. Dazu werden antibiotikagetränkte Blättchen auf eine frische, auf einer Agarplatte aufgebrachte Kultur der zu testenden Bakterien aufgelegt. Die Antibiotika diffundieren in den Agar und hemmen dort das Wachstum der sensitiven Bakterien. Etwa 18 bis 24 Stunden später kann auf den Platten dann ein sogenannter Hemmhof abgelesen werden, der die Wirkung der Antibiotika markiert. Vom Durchmesser des Hemmhofs kann auf die minimale Hemmkonzentration (MHK) zurückgeschlossen werden, also jene Konzentration an Antibiotikum, die am Infektionsort mindestens erreicht werden muss, um den Erreger in seiner Vermehrung zu hemmen.

Agardiffusionstest zur Resistenzbestimmung. a) Ein empfindlicher Keim, bei dem große Hemmhöfe um alle Testblättchen eine gute In-vitro-Wirkung der Antibiotika signalisieren. b) Test eines Erregers mit Multiresistenz, der nur bei zwei Antibiotika lediglich einen vergleichsweise kleinen Hemmhof zeigt. c) Prinzip des Agardiffusionstests: mit wachsendem Abstand zum Testblättchen verringert sich die Konzentration des Antibiotikums. Daraus folgt, dass ein größerer Hemmhof auf eine höhere Empfindlichkeit des zu testenden Erregers schließen lässt (S = sensibel, I = intermediär sensibel, R = resistent; die Abbildung ist schematisch). © O. Nolte, Medizinisches Labor Dr. Brunner

Die Testergebnisse werden anschließend von Mikrobiologen klinisch interpretiert, also in die kategorischen Werte „empfindlich“, „intermediär empfindlich“ und „resistent“ (S/I/R) übersetzt. Neben den Rohdaten fließen auch teilweise weitere Kontrolltests und grundsätzliche Überlegungen zum Resistenzmechanismus mit ein, um beispielsweise statistisch auftretende falsch-resistente oder falsch-sensitive Ergebnisse zu entlarven. Das Ergebnis der interpretierten Messung wird schließlich in ein Resistogramm übersetzt, welches der klinisch tätige Mediziner etwa zwei bis drei Tage nach Einsendung der Probe erhält und als Grundlage für seine gezielte Therapie einsetzt.

Vielfalt in den Methoden der Resistenzbestimmung

Seit einigen Jahren gibt es aber auch Alternativen zu diesem klassischen Agardiffusionstest. „Für zahlreiche Keim-Antibiotika-Kombinationen gibt es kommerzielle, miniaturisierte Systeme, die eine automatische Messung der minimalen Hemmkonzentration erlauben“, berichtet Nolte. Softwaregestützte Expertensysteme übernehmen dabei die prinzipielle Interpretation der gemessenen MHKs. So liefern sie oftmals in deutlich weniger als 24 Stunden eine Einschätzung, ob bei einem gegebenen Erreger und einem gegebenen Antibiotikum klinisch ein Therapieerfolg erwartet werden kann oder nicht. Die tatsächliche Zeitersparnis gegenüber der eher manuellen Agardiffusion kann im optimalen Fall 12 bis 14 Stunden betragen. Für eine schnelle Erkennung, ob resistente Keime vorliegen, kommen häufig auch Screeningnährböden zum Einsatz, auf denen resistente Keime nach 24 Stunden farbig wachsen. „Mit dieser Methode lassen sich aber das Ausmaß der Resistenz sowie mögliche noch wirksame Antibiotika nicht feststellen, sodass bei einem positiven Ergebnis weitere Tests nötig sind“, relativiert Nolte.

Screening auf antibiotikaresistente Keime. Kolonien auf einem Standardnährboden (links) und auf speziellen Screeningnährböden (Mitte und rechts). Die speziellen Nährböden sind mit einem Schlüsselantibiotikum getränkt, sodass, anders als auf Standardnährböden, nur Keime mit einem definierten Resistenzmechanismus wachsen können. Zusätzlich sind chromogene Substanzen beigemengt, die nur von den Zielorganismen verstoffwechselt werden können und dann zu einer charakteristischen Färbung der Kolonien führen (hier: MRSA (Mitte) und β-Lactam-resistente E. coli (ESBL: Extended Spectrum β-Lactamase) (rechts)). © O. Nolte, Medizinisches Labor Dr. Brunner

Spitzenreiter in Sachen Schnelligkeit sind molekularbiologische Verfahren, die es vor allem für den Resistenzmechanismus gibt, der bei methicillinresistenten Staphylococcus aureus (MRSA) zu finden ist. Da sie kulturunabhängig sind und sogar direkt von Patientenproben, beispielsweise von einem Abstrich gemacht werden können, fällt die lange Zeit für die Isolation und Anzucht einer Reinkultur weg und die Tests können innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden. So erhält der behandelnde Arzt noch am selben Tag das Ergebnis. „Gerade im Fall von MRSA stellen die PCR-basierten Methoden eine wesentliche Säule im Hygienemanagement dar“, erklärt Nolte. Denn je eher ein MRSA-Träger als solcher erkannt wird, desto eher können adäquate Maßnahmen ergriffen werden, um die Übertragung dieses MRSA auf andere Menschen im Krankenhaus zu verhindern.

Diese schnelle und zuverlässige Diagnostik ermöglicht seit einigen Jahren ein konsequentes Screening von Patienten aus Risikogruppen, die ins Krankenhaus eingeliefert werden. Darum sind solche Testmethoden auch für andere Bakterienarten sehr wünschenswert. Doch sieht es bei multiresistenten, gramnegativen Erregern, beispielsweise Entero- bzw. Darmbakterien wie E. coli oder Klebsiella pneumoniae bisher nicht so vielversprechend aus. Zwar gibt es auch hier Ansätze für molekularbiologische Tests, doch diese sind für die Routinelabordiagnostik nicht einsetzbar. „Im Gegensatz zu MRSA, bei denen im Wesentlichen ein Gen für den Resistenzmechanismus verantwortlich ist, gibt es bei den Darmbakterien über 800 verschiedene Mechanismen, sodass mittels normaler PCR unmöglich alle abgedeckt würden“, schildert Nolte. Auch ist ein vorhandenes Resistenzgen noch nicht allein entscheidend für die tatsächliche Ausprägung der Resistenz, sodass eine zusätzliche Prüfung der Bakterienkultur auf Agar nötig ist. „Ein breiter, routinemäßiger Einsatz von PCR-Resistenztests bei Enterobakterien ist darum nicht absehbar“, urteilt Nolte.

Schnellere kulturbasierte Analyse durch Massenspektrometrie

Eine neue Methode in der Diagnostik multiresistenter Erreger besteht darin, Resistenzen mittels der sogenannten MALDI-TOF-Massenspektrometrie (Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisation (MALDI) in Kombination mit massenspektrometrischer Flugzeitanalyse (TOF: time of flight)) zu messen. Dabei wird die Masse chemischer Verbindungen exakt bestimmt, sodass kleinste Veränderungen eines Moleküls detektiert werden können. „Bereits vor ca. drei Jahren gab es hierzu erste Ansätze, die allerdings nur wenige Resistenzen und nur ganz bestimmte Mechanismen erfassen konnten, beispielsweise die Spaltung eines Antibiotikums“, schildert Nolte. Mittlerweile wird daher an eleganteren Methoden gearbeitet, bei denen man Mikroorganismen kurzzeitig mit bestimmten Aminosäuren und Antibiotika kultiviert. Die verwendeten Aminosäuren sind dabei durch schwere Isotope markiert. Ist ein Erreger resistent und wächst in Anwesenheit des Antibiotikums, baut er die schweren Aminosäuren in seine Proteine ein, und das resultierende Massenspektrum ist gegenüber der Kontrolle nach rechts verschoben. „Zwar ist auch diese Methode eher noch im experimentellen Stadium, eine Routinenutzung in der Zukunft ist aber gut denkbar“, macht Nolte Hoffnung. Auch für diesen Test wird zwar eine Kultur der zu untersuchenden Bakterien benötigt, doch die Analyse selbst erfolgt in etwa zwei Stunden, sodass bereits am Tag nach der Probenahme ein Ergebnis vorliegt.

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