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Elektrogener Ammonium-Transport über die Membran?

Ohne Stickstoff gäbe es keine Proteine. Bakterien und Pflanzen haben spezielle Membranproteine entwickelt, die das Element in Form von Ammonium-Ionen ins Zellinnere lotsen. Auch beim Menschen sind solche sogenannten Ammonium-Transportproteine gefunden worden. Die Kristallographie hat die Struktur einiger komplex aufgebauter Vertreter geliefert, aber wie sie funktionieren und mit welchen Signalnetzwerken in der Zelle sie interagieren, ist noch unklar. Emmy-Noether-Gruppenleiterin Dr. Susana Andrade und ihr Team von der Universität Freiburg schauen tief ins Innere der Moleküle.

Jede Zelle ist im Import/Export-Geschäft. Wichtige niedermolekulare Stoffe wie Phosphat oder Ammonium sind unentbehrlich für den Aufbau von Proteinen oder Lipiden, und viele von ihnen müssen aus der Umgebung aufgenommen werden. In der Evolution entstanden Membranproteine, die solche Stoffe aktiv oder passiv ins Zellinnere transportieren, man findet sie bereits bei Bakterien. In den Wurzelzellen von Pflanzen sitzen teilweise Millionen von Transportproteinen, die Ammonium aufnehmen. Ammonium ist die chemische Form, in der ein Organismus Stickstoff assimilieren kann. Es wird in komplizierten biochemischen Kreisläufen in Aminosäuren eingebaut und diese wiederum in Proteine. Auch beim Menschen sind Ammonium-Transportproteine gefunden worden, zum Beispiel die Vertreter der Rhesusprotein-Familie, die für die Blutgruppenerkennung wichtig sind. Sie sitzen in den Membranen von Blut- oder Nierenzellen, wo sie zum Beispiel den pH oder den Ionenhaushalt regulieren. „In den letzten Jahren wurde die Kristallstruktur einiger Vertreter aufgeklärt“, sagt Dr. Susana Andrade, Emmy-Noether-Gruppenleiterin am Institut für Organische Chemie und Biochemie an der Universität Freiburg. „Aber im Prinzip wissen wir noch so gut wie nichts über die Funktionsweise dieser Moleküle.“

Der Transportmechanismus ist unbekannt

Andrade hat in den letzten Jahren die Kristallstruktur eines Ammonium-Transportmoleküls in dem Bakterium Archaeoglobus fulgidus aufgeklärt. Mit einer Auflösung von 1.4 Angström (ein Angström entspricht 0,1 Nanometer) können sie und ihr Team heute ins Innere des Moleküls blicken und jede einzelne Aminosäure anschauen. Das Molekül ist aus drei identischen Monomeren aufgebaut. Jedes dieser Monomere hat elf Helizes, die die Membran durchspannen. Zudem besitzt jedes Monomer einen Kanal, der durch eine spezielle Anordnung von zwei Aminosäuren verschlossen wird. Aus anderen Untersuchungen wissen die Forscher, dass das Protein den Import von Stickstoff in die Bakterienzelle vermittelt. Aber das war’s auch schon. Der Transportmechanismus ist unbekannt. Handelt es sich bei dem Transportprotein um einen passiven Kanal, der Ammonium in Form des positiv geladenen Ions NH4+ durchlässt, solange der Ionengradient für dessen Diffusion sorgt? Oder ist das Protein eine aktive, energieabhängige Schleuse, die sein Substrat unter Konformationsänderungen transportiert?

Diese Frage ist extrem schwer zu beantworten. Es ist zum Beispiel unklar, was überhaupt das konkrete Substrat des Proteins ist. Handelt es sich um das positiv geladene Ammonium-Ion? Oder um das elektrochemisch neutrale Ammoniak-Gas? „Die Kristallographie erlaubt einen Blick auf die Molekülstruktur eines Proteins und ist damit eine der aussagekräftigsten Methoden“, sagt Andrade. „Aber in unserem Falle sind Aussagen über die Funktion des Transportproteins mit ihrer Hilfe nicht möglich.“

Oft können Forscher Transportproteine zusammen mit dem Molekül kristallisieren, das von ihnen transportiert wird. Dann wissen sie, was durch die Membran geschleust wird. Aber die Kristallographie macht molekulare Strukturen sichtbar, weil sie die Elektronenverteilung in einem Kristall misst, die sich von Atom zu Atom und von Molekülbindung zu Molekülbindung unterscheiden. Das kristallisierte Ammonium-Transportprotein von Archaeoglobus fulgidus ist von Wassermolekülen durchdrungen, und Wassermoleküle haben eine ähnliche Elektronenverteilung wie Ammonium. Die Forscher um Andrade sind nicht in der Lage, zu unterscheiden, was von beiden sie im Inneren des Kanals sehen. „Wir müssen also eine andere Methode finden, um das zu klären“, sagt Andrade.

Ist die Fracht geladen?

In dieser Apparatur untersuchen die Forscher um Dr. Susana Andrade aus Freiburg winzige Membranstückchen mithilfe von Elektroden. © Dr. Susana Andrade.

Zurzeit versuchen die Freiburger Biochemiker diese Frage mithilfe der Elektrophysiologie zu beantworten. Sie spannen hierzu winzige künstliche Membranstücke zwischen zwei Kammern mit physiologischer Lösung. In die Membranstücke integrieren sie das zu untersuchende Transportprotein. Durch Anlegen einer Spannung können sie Ionen in der Lösung dazu anregen, sich über die Membran zu bewegen. Ist das Substrat des Transportproteins das elektrochemisch neutrale Ammoniakgas, dann misst die Methode nichts. Aber ist es das Ammonium-Ion, dann werden die Wissenschaftler mithilfe von Elektroden charakteristische Stromflüsse messen können. In diesem Fall können sie unter Umständen sogar Rückschlüsse über die konkrete Funktionsweise des Kanals machen. Je nachdem, wie die Stromflüsse sich in der Zeit verändern oder ob sie erst ab einer gewissen Spannungsschwelle fließen und so weiter. „Wir versprechen uns sehr viel von dieser Methode“, sagt Andrade. „Und selbst wenn wir keine Ströme messen können, haben wir eine Aussage: Das Substrat unseres Transportproteins ist dann mit Sicherheit kein Ion.“ Die Forscher werten zurzeit die ersten Ergebnisse aus.

Die Kristallstruktur eines Ammonium-Transportmoleküls von Archaeoglobus fulgidus (oben) und des intrazellulären Proteins Gln-K, das den Öffnungszustand zu regulieren scheint. © Dr. Susana Andrade

Der Mechanismus des Transports könnte ziemlich komplex sein, das immerhin ist bereits klar. Eine Aminosäurebarriere im Inneren des Kanals zum Beispiel kann nicht die einzige Stelle sein, an der ein Substrattransport reguliert wird. Denn sie muss zwar offen sein, damit die Zelle Ammonium aufnimmt, aber wenn sie fehlt, dann ist der Kanal nicht automatisch offen. Das wissen Andrade und ihre Mitarbeiter aus Experimenten, in denen sie die beiden beteiligten Aminosäuren manipuliert haben. Und dann kommt noch eine weitere Ebene der Komplexität hinzu. Im Inneren der Bakterienzelle wurde ein Molekül identifiziert, das mit dem Ammonium-Transportprotein interagiert. Es handelt sich dabei um das Protein mit dem Namen Gln-K, das unter anderem dazu in der Lage ist, den Energielevel und den Spiegel an Ammonium in der Zelle zu messen. „Dieses Protein reguliert offenbar den Öffnungszustand des Ammonium-Transportproteins“, sagt Andrade. Es verfügt an einem Ende über eine Art Schlaufe, die genau ins Innere des Kanals passt und diesen verschließen kann, das haben kristallografische Untersuchungen gezeigt. Und das ergibt biologisch auch einen Sinn, denn die Zelle will kein Ammonium aufnehmen, wenn sie genug davon in ihrem Inneren hat oder wenn sie zu wenig Energie in Form von ATP besitzt.

Neben den elektrophysiologischen Experimenten wollen Andrade und ihr Team in Zukunft auch die molekularen Vorgänge rund um Gln-K näher untersuchen. Und vielleicht gelingt es ihnen irgendwann, den Mechanismus des Transports und seiner Regulation in allen Einzelheiten aufzuklären. „Es handelt sich um ein sehr kompetitives Feld“, sagt Andrade. „Aber die Einsichten sind auch sehr wichtig, zum Beispiel im Zusammenhang mit den möglichen Rückschlüssen auf die menschlichen Rhesusproteine und deren Funktionsweise.“

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