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Ionera – Klitzekleine Ströme messen

Die Identifizierung und Charakterisierung einzelner DNA oder Proteinmoleküle sind von zunehmender Wichtigkeit. Mit einem von Dr. Gerhard Baaken und Prof. Dr. Jan C. Behrends an der Universität Freiburg entwickelten Verfahren soll es ab Herbst quasi für jedermann möglich sein, mit Hilfe von Nanoporen eine automatisierte Einzelmolekülanalyse im Hochdurchsatz zu realisieren. Die MECA- (Microelectrode Cavity Array) Technologie soll maßgeschneiderte Lösungen für unterschiedlichste Anwendungen liefern.

Ionera (v.l.n.r.): Dr. Sönke Petersen, Dr. Ekaterina Zaitseva, Prof. Dr. Behrends, Dr. Gerhard Baaken © Dr. Gerhard Baaken, Universität Freiburg

„Wir haben uns zum Ziel gesetzt, mit Hilfe von Membranproteinen alles messen zu können, was mit Ionen und Salzlösungen zu tun hat“, schildert Dr. Gerhard Baaken von der Universität Freiburg den Impuls, der zu der Idee der Firmengründung von Ionera geführt hat. „Der Name Ionera mit dem Slogan „...wherever ions flow.“ soll dabei für eine neue Ära der Elektrophysiologie mit Anwendung in der molekularen Analyse stehen“, so der Ingenieur.

Baaken studierte in Freiburg Mikrosystemtechnik und wurde 2008 am Freiburger Institut für Mikrosystemtechnik (IMTEK) bei Prof. Dr. Jürgen Rühe promoviert. Sein Promotionsthema war die Herstellung kleiner Chips zur Messung von Ionenstrom mit Membranen; eine Aufgabe, die in Zusammenarbeit mit Prof. Jan C. Behrends vom Institut für Physiologie der Universität Freiburg gelöst wurde. „Vom Beginn der aktiven Zusammenarbeit zwischen Mikrosystemtechnik und Physiologie bis zu unserer tatsächlichen Gründung diesen Herbst sind es ziemlich genau acht Jahre“, rechnet Gerhard Baaken nach. Gefördert werden sie dabei durch das EXIST-Programm des Bundesministeriums für Wirtschaft und Technologie (BMWi). Neben Baaken und Behrends sind die Biophysikerin Dr. Ekaterina Zaitseva sowie der Ingenieur Dr. Sönke Petersen Mitglieder des Teams Ionera.

Veränderung des Ionenstroms in Nanoporen

Ein Molekül (z.B. DNA-Einzelstrang) geht durch eine Nanopore und verändert den Ionenstrom aufgrund der Größe seiner Bestandteile (z.B. Basen) © : Dr. Gerhard Baaken, Universität Freiburg

Die Erfindung von Baaken und seiner Mitarbeiter beruht auf der Messung der Ionenleitfähigkeit in winzig kleinen Poren, die in einer künstlichen Zellmembran liegen. Tatsächlich lassen sich mit Hilfe derartiger Poren Größe und Beschaffenheit einzelner Moleküle wie Proteine, DNA und Polymere sehr genau bestimmen. Dafür müssen die in Salzlösung befindlichen Moleküle sich allerdings die Pore hineinbewegen. Indem das größere Molekül, das sich in der Lösung befindet, durch die Pore hindurchschlüpft, "wird diese Pore teilweise verstopft, das heißt, der Ionenstrom sinkt kurzzeitig ab", erklärt der Ingenieur, "und am Grad dieser Verstopfung kann man auf die Größe und Zusammensetzung der blockierenden Moleküle schließen."

Die Veränderung des elektrischen Widerstands an der Nanopore wird gemessen. Ähnlich wie bei einer Lichtschranke lässt sich etwa die Anwesenheit eines Peptids in Echtzeit detektieren. Dabei muss der Analyt, das zu untersuchende Teilchen, selbst nicht geladen sein, er muss nur durch die Pore passen. Verwendet wird für solche Poren häufig das Toxin des Bakteriums Staphylococcus aureus, das sogenannte alpha-Hämolysin, das im infizierten Organismus in die Membran der roten Blutkörperchen integriert wird. Der Vorteil biologischer Nanoporen ist, dass deren Leitfähigkeit relativ stabil ist. Auch können sie durch Mutation und chemische Modifikation bequem verändert werden, so dass neue Bindungsstellen für bestimmte Analyten entstehen. „Die Nanopore ist natürlich nicht unsere, sondern die Erfindung der Natur“, betont Baaken, „wir machen sie uns nur zu Nutze.“ Mit welcher Neuerung geht Ionera aber nun in die Gründung?

Bedeutsames Werkzeug in der Bioanalytik

MECA-Chip zur automatisierten Nanoporenanalyse, Größe 1 x 2 cm © Dr. Gerhard Baaken, Universität Freiburg

Der Knackpunkt der Nanoporenanalyse ist die künstliche Herstellung der Lipidmembran (BLM: Black Lipid Membranes), in die die Pore eingesetzt wird – in der Tat eine diffizile Angelegenheit. „Die gegenwärtigen Methoden können nur händisch von Spezialisten durchgeführt werden“, erklärt der Mikrosystemtechniker. Beim so genannten Painting werden ähnlich wie beim Verstreichen von Farbe Membranbestandteile, die Phospholipide, in einer öligen Lösung mit Hilfe eines kleinen Teflon-Spatels über eine Öffnung in einer Trennwand zwischen zwei Kammern aufgebracht, bis sie als hauchdünne Membran einen dichten Verschluss bilden. Ein empfindliches und aufwendiges Verfahren, das mal funktioniert und dann ohne erkennbaren Grund erfolglos bleibt. „Es war immer ein bisschen Voodoo dabei“, scherzt Baaken. „Ein BLM-Pionier berichtet über aus Frustration an die Wand geworfene Laborgläser, ein anderer empfahl seinen Studenten im Versagensfalle einerseits alle Ingredenzien neu anzumischen, vor allem aber auch die Socken zu wechseln.“ Des Weiteren ist die Methode wenig verlässlich und nicht automatisierbar. Um der Komplikation Herr zu werden, entwickelten Baaken und sein Team den MECA-Chip, eine Plattform von zwei Quadratzentimetern, in deren Mitte ein aktives Zentrum mit 16 Sacklöchern liegt. Die Löcher, welche die Plattform nicht ganz durchdringen, sind mit einem Durchmesser von 6-50 Mikrometern, acht Mikrometer tief, dicht im Abstand von 100-200 Mikrometern zueinander arrangiert. Um das aktive Zentrum herum liegen die zu den Minitöpfchen gehörenden Kontaktflächen, die den Ionenstrom in der Salzlösung zwischen den Elektroden an den Verstärker weiterleiten. Gerhard Baaken erläutert das Wichtigste an der Erfindung: „Wir haben ein automatisiertes Verfahren entwickelt, wie sich synthetische Zellmembranen auf diesem Chip planar ausformen lassen – und das auf Knopfdruck.“ Geht eine mal kaputt, drückt man einfach noch mal auf den Knopf. Im Vergleich zu vorher ist das ein Riesenschritt, denn bei dem Ionera-Spread-Verfahren liegt nun die Erfolgsrate im Ausbilden der BLM bei fast 100 Prozent.

Der heilige Gral: die Gensequenzanalyse

Entstanden ist hier eine Plattformtechnologie für die schnelle, automatisierte elektrische Messung einzelner Moleküle an Nanoporen in hohem Durchsatz. Jedes Töpfchen mit künstlicher Membran enthält dabei nur eine einzelne Nanopore und erzeugt ein eigenes Strombild. Dieses Werkzeug ist perfekt im Kontext der Pharmaindustrie einsetzbar, wobei die Anzahl der Vertiefungen im aktuellen Prototyp noch bei 16 liegt, laut Baaken jedoch beliebig skalierbar ist. Hier kann im Hochdurchsatz Markerfreie molekulare Analyse gemacht, Detektion und Charakterisierung von Proteinen betrieben, sowie Einzelmolekül-Massenspektrometrie durchgeführt werden.
„Unser Gerät ist ein generisches Werkzeug, mit dem man unglaublich viel machen kann“, demonstriert Baaken, „was die Leute damit machen, entscheiden sie selbst. Wir bieten eine ganze Bandbreite an Möglichkeiten an.“
Die bioelektrische Nanoporenanalyse ist deshalb attraktiv, weil sie neben hoher Präzision und Informationsgehalt noch Zeit und Kosten spart. Aber: „Der heilige Gral, hinter dem wir alle her sind, ist das DNA-Sequencing“, eröffnet der Ingenieur. Und dies ist offensichtlich greifbar geworden. „Die verschiedenen Basen einer Einzelstrang-DNA kann man sich hier wie eine Perlenschnur mit verschieden großen Perlen vorstellen“, erklärt er, „sie verstopfen die Pore unterschiedlich stark und so kann man die einzelnen Basen aus dem Strom herauslesen.“

Produktpalette und Service von Ionera

Bis zur offiziellen Gründung im Herbst muss zwar noch einiges erledigt werden, aber die wichtigsten Weichen sind gestellt. Während Ionera sich ganz auf die Produktion der Chips sowie der Analyse-Kits konzentriert stellt die Nanion Technologies GmbH, eine frühere Ausgründung aus dem Labor von Prof. Behrends, die passenden Messgeräte bereit. Ein weiterer wichtiger Schwerpunkt des Ionera-Teams ist das Assay-Development: das Ionera-Team entwickelt Chip-Layouts und Kits für spezielle Anwendungen. So kann das „Päckchen“ von Ionera in wenigen Jahren schon zur Standardmethode in der Biotechnologie avancieren.

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