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Metallwürfel, Eiweißlandschaften und der globale Stickstoffkreislauf

Ohne Stickstoff geht im Leben gar nichts. Eine Schlüsselrolle im globalen N-Kreislauf spielen Bakterien, denn sie haben die notwendige Enzymausstattung, um die verschiedenen Stickstoffgase aus der Atmosphäre für andere Lebewesen verwertbar zu machen. Wie arbeiten diese Enzyme? Auch für die Industrie eine interessante Frage, denn die heutigen Verfahren zur Stickstoff-Produktion für Pflanzendünger und andere Anwendungen sind sehr ineffizient. Prof. Dr. Oliver Einsle und sein Team von der Universität Freiburg blicken bis in die reaktiven Zentren der bakteriellen Moleküle hinein, die allesamt Metallionen beinhalten. Es sind diese Metallionen, die die entscheidenden chemischen Reaktionen vermitteln. Was passiert im Innersten der bakteriellen Proteine? Und wie kann man überhaupt einen Einblick bekommen?

Stickstoff ist essenzieller Bestandteil von Aminosäuren und damit von allen Proteinen. Auch die DNA beinhaltet Stickstoff-Atome. Ohne das Element würde in unserem Körper nichts mehr funktionieren. Höhere Organismen wie der Mensch können es jedoch nur in der vollständig reduzierten Form aufnehmen, als Ammoniumion. Der Stickstoff, der in der Erdatmosphäre als Stickstoff-Gas N2 oder in oxidierter Form als NO2, N2O oder NO vorkommt, ist damit nicht verwertbar. In eine verwertbare Form bringen ihn erst die Pflanzen, denn sie gehen Symbiosen mit Bakterien ein, die den atmosphärischen Stickstoff im Prozess der sogenannten Stickstofffixierung in Ammoniumionen umwandeln. Die Pflanzen bauen die Ammoniumionen ihrerseits in Aminosäuren ein, die wir dann über die Nahrung aufnehmen. Nach unserem Tod bauen Bakterien im Boden die höheren Stickstoffverbindungen über viele chemische Zwischenstufen wieder zu den Stickstoffgasen ab, die in die Atmosphäre entweichen. Dieser Vorgang wird als Denitrifikation bezeichnet.

Der Industrie überlegen

Der einzigartige Metallcluster im Zentrum der Nitrogenase. Eisen- (grau) und Schwefelatome (gelb) sind auf zwei konzentrischen Kugelschalen rund um ein leichtes Atom (Kohlenstoff, Stickstoff, oder Sauerstoff) angeordnet. Ober- und unterhalb des Metallzentrums sind Teile des Proteinmoleküls gezeigt, die den Cluster im Enzym verankern. © Prof. Dr. Oliver Einsle

Eines der Enzyme, das bei der Stickstoffaufarbeitung eine wichtige Rolle spielt, heißt Nitrogenase. Dieses komplexe Protein ist bei vielen Bakterien zu finden, die mit Pflanzen Symbiosen eingehen. Es kann N2 in Ammoniumionen umwandeln und hilft damit, den atmosphärischen Stickstoff in die Nahrungsketten einzuspeisen. In seinem Zentrum beinhaltet das Enzym zwei Würfel, die aus Eisen- und Schwefelatomen aufgebaut sind. Einer dieser sogenannten Eisen-Schwefel-Cluster, der auch ein Molybdänatom beinhaltet, vermittelt die eigentliche Reaktion. „In diesem Zentrum, das aus so wenigen anorganischen Atomen aufgebaut ist, läuft eine sehr ungewöhnliche Chemie ab“, sagt Prof. Dr. Oliver Einsle vom Institut für Organische Chemie und Biochemie der Universität Freiburg. „Was im industriellen Haber-Bosch-Verfahren, allerdings unter extremen Druck- und Temperaturbedingungen und auch nur mit einer sehr niedrigen Ausbeute, gelingt, bringt in der Natur dieses eine Enzym fertig.“

Im Haber-Bosch-Verfahren entstehen aus N2 Ammoniumionen. Es wird zum Beispiel in der Kunstdüngerproduktion eingesetzt. Pro Tonne umgewandelten N2 wird jedoch Energie verbraucht, die der Erzeugung von rund 1,7 Tonnen CO2 entspricht. Außerdem: Der produzierte Dünger kommt nur zur Hälfte bei den Pflanzen an, die andere Hälfte wird von Bodenbakterien wieder abgebaut. Untersuchen Chemiker Metallo-Proteine wie die Nitrogenase, dann steht also immer auch ein Gedanke an die industrielle Anwendung im Raum. „Es wäre schön, Pflanzen die Fähigkeit zu geben, den Stickstoff aus der Luft selbst in die richtige Form umzuwandeln“, sagt Einsle. Dazu müssen Wissenschaftler die bakteriellen Enzyme aber erst vollständig verstanden haben. Wo genau im Zentrum des Enzyms lagert sich das Edukt (also das N2-Gas) ein? In welchen Zwischenschritten werden die Elektronen von den Eisenatomen auf den Stickstoff übertragen? Einen ersten Ansatz, um diese Fragen zu beantworten, stellt eine Strukturanalyse dar. Wissen Forscher, wie das Protein der Wahl räumlich aufgebaut ist, dann können sie schon hieraus erste Vermutungen über die Abläufe während der Reaktion anstellen.

Die Seefahrer und die Terra incognita

Einsle und sein Team verfügen über das Know-how und die technische Ausstattung, um die Proteine zu kristallisieren. In den Kristallen messen sie die räumliche Verteilung von Elektronen. Aus dieser Verteilung wiederum können sie ein Modell des dreidimensionalen Proteins berechnen. Aber diese Arbeit ist keine Standardprozedur, im Gegenteil. Es kann Monate dauern, bis die Proteine aus dem Probengewebe isoliert und aufgereinigt sind. Und erst danach kommt der wirklich anspruchsvolle Schritt: „Die Züchtung von Proteinkristallen ist im Grunde ein alchimistischer Vorgang“, sagt Einsle. „Man muss zunächst durch Versuch und Irrtum nach den geeigneten Druck-, Temperatur- und Konzentrationsbedingungen suchen, damit sich das Protein der Wahl überhaupt in einem Kristall anordnet. Man muss manchmal Tausende von Experimenten durchführen, bis das gelingt, und ein Erfolg ist im Vorhinein nie garantiert.“

Das blaue Netz zeigt eine experimentelle Elektronendichtekarte, das Ergebnis eines Röntgenbeugungsexperiments. In diese dreidimensionale Karte wird anschließend per Hand ein aus einzelnen Atomen bestehendes Strukturmodell gebaut und eingepasst. © Prof. Dr. Oliver Einsle

Ist es den Forschern gelungen, bestrahlen sie die mikrometergroßen Kristalle im sogenannten Röntgendiffraktometer mit Röntgenstrahlen. Die um die Atome des Proteins schwirrenden Elektronen lenken die energiereichen Strahlen auf charakteristische Weise ab. Diese Beugungsmuster können die Forscher messen, sie werden ihnen von einem Computerprogramm in ein komplexes, dreidimensionales Gitternetz umgerechnet. In manchmal wochenlanger Fleißarbeit muss das Chaos nun interpretiert werden. Gibt es charakteristische Strukturen, die sich bekannten Aminosäuren zuordnen lassen? Sind übergeordnete Helices sichtbar? Nach und nach entsteht das Modell des Proteins mit seinen Zigtausenden Atomen. Auf diese Weise entschlüsselten Einsle und seine Gruppe die dreidimensionale Struktur der Nitrogenase mit den zwei Eisen-Schwefel-Clustern.

„Die Kristallografie ist eine richtige forschende Wissenschaft“, sagt Einsle. „Wir gehen raus und sehen, was noch keiner vor uns gesehen hat. Ich fühle mich manchmal als Seefahrer, der eine terra incognita vor sich hat.“ Momentan versuchen die Biochemiker zu verstehen, was in dem reaktiven Zentrum der Nitrogenase auf chemischer Ebene passiert. An welchen Eisenatomen läuft die Reaktion ab? Wie genau richtet sich das Stickstoff-Molekül im Inneren des Proteins aus? Welche Aminosäuren des Proteins sind hierfür essenziell? Um solche Fragen zu beantworten, müssen die Wissenschaftler die Ergebnisse verschiedenster Experimente zusammenführen. Dazu gehören zum Beispiel auch die zielgerichtete Mutagenese von Aminosäuren im Protein oder biochemische Versuche, die den Umsatz von N2 durch das Enzym messen. Zurzeit untersuchen die Forscher durch die Manipulation verschiedener Gene, wie das Metallzentrum hergestellt und ins Protein eingebaut wird.

Aus den Life Sciences nicht mehr wegdenkbar

Räumliche Struktur des Enzyms Distickstoffmonoxid-Reduktase (N2O-Reduktase). Das Protein besteht aus zwei Aminosäureketten (grün und blau), die der Übersicht halber als Bändermodell dargestellt sind. Das vollständige Modell beschreibt die exakten Positionen von über 10.000 einzelnen Atomen. Die reaktiven Metallzentren der N2O -Reduktase enthalten Kupferionen, die im Bild als Kugeln dargestellt sind. © Prof. Dr. Oliver Einsle

Mithilfe der Kristallografie sind Einsle und Co. bei einem anderen Enzym schon etwas weiter gekommen: der Purpurnen Distickstoffmonoxid-Reduktase (N2O-Reduktase). Dieses Enzym, das in seinem reaktiven Zentrum einen Würfel aus Kupferatomen enthält und deshalb violett gefärbt ist, katalysiert ebenfalls einen Schritt im globalen Stickstoffkreislauf: die letzte Reaktion der Denitrifikation. Bei diesem Schritt wird aus dem Gas N2O das Gas N2, das in die Atmosphäre entweicht oder wieder zu Ammoniumionen reduziert werden kann. Einsle und sein Forschungsteam haben die räumliche Struktur des Enzyms aufgeklärt. Sie haben zusätzlich dazu herausgefunden, wie sich die N2O-Moleküle an dem Kupferwürfel im Zentrum des Metallo-Proteins anordnen. Jetzt geht es darum, den genauen Mechanismus der Reaktion aufzuklären. Dabei stellt sich auch die Frage, ob man den Vorgang synthetisch nachstellen kann.

Die Enzyme des Stickstoffmetabolismus dienen den Bakterien zur Energiegewinnung. Sie sitzen allesamt an den Membranen des Bakteriums. Bei den Reaktionen, die sie katalysieren, werden immer auch Protonen frei (also positiv geladene Wasserstoffionen). Diese werden über die Membranen gepumpt, wobei Energie frei wird. Neben der Forschung an den Enzymen des globalen Stickstoffkreislaufs interessieren sich die Biochemiker um Einsle daher auch allgemein für die Funktion von Membranproteinen. Wie transportieren sie Protonen? Wie entsteht dabei Energie? Die Einsle-Gruppe ist seit zwei Jahren in Freiburg und profitiert von Kooperationen mit Arbeitsgruppen aus der Chemie, Medizin, Biologie oder Pharmazie. Diese Gruppen liefern den Forschern Probenmaterial, aber auch neue Ideen und Fragestellungen. Im Gegenzug klären Einsle und seine Mitarbeiter die Strukturen der Proteine auf, an denen die Kooperationspartner interessiert sind. „Von verschiedenen Seiten kommen Leute auf uns zu und wollen wissen, wie ihre Proteine aussehen“, sagt Einsle. „Solche Projekte sind immer für beide Seiten fruchtbar.“ Die Röntgenkristallografie ist aus den modernen Life Sciences nicht mehr wegdenkbar – ähnlich wie einst die Mikroskopie.

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