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Proteinkristallisation: Attraktive Alternative

Die Herstellung reiner Kristalle ist ein Verfahren, das normalerweise nur zur Bestimmung der räumlichen Struktur eines Proteins mit Hilfe der Röntgenbeugung angewandt wird. Proteine im kristallinen Zustand sind in einer sehr regelmäßigen Struktur geordnet, so dass Verunreinigungen weitgehend aus dem Kristall ausgeschlossen werden. Daher enthalten Proteinkristalle nur eine kleine Menge an Fremdsubstanzen, was sie in der Regel stabiler macht, als sie es in der Lösung sind. Aufgrund dieser Eigenschaften ergeben sich auch eine Reihe möglicher Anwendungen für die Kristallisation in industriellen Proteinaufarbeitungsprozessen. So kann das Verfahren etwa für die Aufreinigung, die Formulierung oder die Lagerstabilisierung von Proteinen angewandt werden.

Prof. Roland Wagner leitet die Entwicklung bei Rentschler Biotechnologie © Rentschler Biotechnologie

Insbesondere verspricht sich der biopharmazeutische Hersteller von dieser Methode den Vorteil, effiziente, aber teure Schritte, wie den der Affinitätschromatographie, durch einen vergleichsweise einfachen und preiswerten, jedoch in seiner Effizienz vergleichbaren Prozessschritt einzusparen.

Nicht nur das: "Eine derartige Aufreinigung spart enorm viel Zeit", sagt Prof. Roland Wagner, Entwicklungsleiter von Rentschler Biotechnologie. Der Auftragshersteller aus Laupheim beteiligt sich mit dem Biberacher Nachbarn Boehringer Ingelheim und der Universität Karlsruhe sowie der Hochschule Biberach an einem durch das BMBF geförderten Projekt zur technischen Proteinkristallisation.

Herausforderung: Kristalle aus schmutzigen Lösungen

"Im Prinzip ist das Problem der Proteinkristallisation längst gelöst", sagt Roland Wagner. Seit der Kristallisation des Enzyms Urease im Jahr 1926 wird die Proteinkristallisation betrieben und hat gezeigt, dass sie den gleichen Prinzipien folgt wie die Kristallisation niedermolekularer Substanzen (Jones, Ulrich: Industrielle Kristallisation von Proteinen – Eine Frage der Aktivität, in: Chemie Ingenieur Technik 2005; 77, Nr. 10).

Der feine Unterschied aber ist, dass diese Kristalle aus hochreinen Proteinlösungen gewonnen werden. Ungleich schwieriger ist jedoch die Kristallisation aus „schmutzigen“ Protein-Lösungen, so wie sie in der Fermentationsbrühe nach dem Upstream-Prozess vorliegen. Genau dort setzt das Verbundprojekt an.

Das Bild zeigt ein gutes Dutzend Proteinkristalle, aufgenommen unter polarisiertem, rosa schimmerndem Licht. Sie haben durchweg eckige Formen.
Die Kunst des Verbundprojekts wird es sein, nicht hochreine Proteine, sondern "schmutzige" Proteine aus der Fermentationsbrühe zu kristallisieren. Im Bild Proteinkristalle unter polarisiertem Licht. © Wikipedia

"Jeder Schmutz sorgt für einen unreinen, unfertigen Kristall, die Aufreinigung bleibt unvollständig", so Wagner. Die Herausforderung der Projektanten wird es sein, unter diesen erschwerten Umständen gute und reine Kristalle zu erhalten, die mit den hochkomplexen, den Kristall störenden Nährmedienbestandteilen, in denen die Proteine schwimmen, zurechtkommen.

Ziel des Verbundprojekts ist es daher, durch geeignete Bedingungen reine Kristalle aus diesen Vielstofflösungen zu gewinnen. Daran arbeiten nicht nur die Partner in Baden-Württemberg. "Technische Proteinkristallisation wird schon in der Forschung von der Arzneimittelindustrie eingesetzt", sagt Wagner. Das vom Bund geförderte Unterfangen ist dennoch lohnenswert. Denn die andernorts möglicherweise schon praktizierte technische Umsetzung wird entweder nicht offen gelegt oder wäre patentgeschützt und daher für andere Hersteller kaum anwendbar.

Proteinlöslichkeit hängt von vielen Größen ab

Proteinlöslichkeit ist eine komplexe Größe, die von vielen Parametern abhängt. Proteine liegen in wässriger Lösung vor und lassen sich anders als niedermolekulare Substanzen wegen ihrer Temperaturempfindlichkeit nicht durch Verdampfen des Lösungsmittels kristallisieren. In Frage kommen deshalb bestimmte Salze, die die Proteine ausfällen (Aussalzen).

Als beste und zugleich preiswerte Fällungsmittel haben sich das Sulfatanion und das Ammoniumsulfat durchgesetzt. In Frage kommen grundsätzlich aber auch andere Fällungsmittel wie niedermolekulares Polyethylenglykol. Ebenfalls bei der Wahl der Kristallisationsbedingungen beachtet werden muss der pH-Wert der Lösung, der die Stabilität des Proteins und auch seine Löslichkeit stark beeinflusst.

Auch wenn eine Kristallbildung auf diese Weise möglich ist, sind für den industriellen Herstellungsprozess noch eine Reihe zentraler Fragen zu beantworten. Diese beziehen sich auf die Reproduzierbarkeit und Robustheit des Kristallisationsverfahrens und seine Eignung in einem pharmazeutischen Herstellungsprozess nach guter Herstellpraxis.
Des Weiteren spielt die Zeit eine große Rolle: Eine Kristallisation unter Industriebedingungen darf nicht Tage dauern und muss in möglichst hoher Ausbeute unter Berücksichtigung der Gesamtökonomie des Prozesses zu gewährleisten sein.
Die verwendeten Fällungsmittel dürfen nicht toxisch sein und müssen im Anschluss an die Kristallbildung wieder vollständig aus dem System entfernbar sein. Die Lagerung der kristallinen Suspension sollte möglichst bei Raumtemperatur erfolgen können, um eine einfache Handhabung zu ermöglichen.

Weniger Volumen, größere Stabilität

Vorbereitung einer Chromatographiesäule © Rentschler Biotechnlogie

Um den Prozess schnell kennenzulernen, beginnt man die Kristallisation mit bereits aufgereinigtem Protein und geht schrittweise auf zunehmend unreineres Material über. Ziel bei der Kristallisation des reinen Produkts ist es, eine stabile Formulierung der Proteine in kristalliner Form zu etablieren.

Der kommerzielle Nutzen dieses Verfahrens wird darin bestehen, dass eine wesentliche Volumenreduzierung des Bulk-Wirkstoffes und voraussichtlich auch eine Stabilisierung erreicht werden, so dass eine ungekühlte Lagerung denkbar ist. Im nächsten Schritt wird Protein dann auf der Vorreinigungsstufe kristallisiert. Zusätzlich kann damit auch ein Chromatographieschritt ersetzt werden. Anschließend untersucht man, ob sich das so generierte Verfahren auch als Capturing-Methode eignet, wodurch sich enorme Kosten im Vergleich zu den heute verwendeten affinitätschromatographischen Verfahren einsparen ließen.

Zunächst wird nach Kristallisationsbedingungen im Mikrolitermaßstab gesucht. Dabei werden die aus der Röntgenstrukturanalyse bekannten Dampfdiffusionsverfahren eingesetzt, die es erlauben, Experimente mit geringen Proteinmengen durchzuführen. Die Bildung von Kristallen wird dabei im Mikroskop beobachtet. Kristalle können manuell aus diesen Ansätzen geerntet und analysiert werden.
Im nächsten Schritt werden, von diesen Bedingungen ausgehend, jeweils nur wenige Parameter systematisch variiert, um deren optimale Einstellung zu finden.

Hochskalierung im Rührkessel

Verlassen die Versuche den Kleinmaßstab, werden sie in Rührkesseln fortgesetzt, die sich gut hochskalieren lassen. Unser Bild zeigt einen Rührkesselfermenter. © Rentschler Biotechnologie

Sind die Bedingungen im Kleinmaßstab etabliert, beginnt die Hochskalierung der Proteinkristallisation in Rührkesseln, die vom verfahrenstechnischen Standpunkt sehr gut verstanden und daher auch jederzeit skalierbar sind. Vorteilhaft sind kleine Rührkessel mit einer präzisen Steuerung der Rührgeschwindigkeit und guter Temperierbarkeit, die leicht in einen größeren Maßstab überführbar sind. Dabei wird insbesondere darauf geachtet, dass die Größenverteilung und Morphologie der Kristalle mit den späteren Abtrennungsverfahren kompatibel ist.

Sollte das Unterfangen erfolgreich sein, rechnet Wagner mit zwei weiteren Jahren, um das Konzept in den Produktionsprozess umzusetzen.

Zweites Rentschler-Projekt: Aufreingigung polymermodifizierte Proteine durch standardisiertes Chromatographieverfahren

In einem zweiten, ebenfalls vom BMBF geförderten Verbundprojekt, beschäftigen sich Rentschler und Partner aus Industrie und Akademie mit der Aufreinigung polymermodifizierter Proteine. Beteiligt sind daran das im hessischen Dreieich ansässige Biotech-Unternehmen Biotest AG, Spezialist für Immunologie und Hämatologie, der Stuttgarter Hersteller von Chromatographiematerialien, die Tosoh Bioscience, des Weiteren der Aufreinigungsspezialist Sartorius aus Göttingen sowie der Lehrstuhl für Molekulare Aufarbeitung von Bioprodukten der Universität Karlsruhe, die Universität Kaiserslautern (Lehrstuhl für Thermodynamik) und das Institut für Zellbiologie und Immunologie der Universität Stuttgart.

Die Partner des Projekts versuchen über eine Art standardisiertes Chromatographieverfahren die immensen Aufreinigungskosten einzudämmen. Durch die Anbindung großer Polymere an die Proteine kann ein ganzheitlicher, vom eigentlichen Zielprotein weitgehend unabhängiger Aufreinigungsprozess generiert werden, der auf fast alle so modifizierten Proteine anwendbar ist.

Gleiche Matrix für möglichst viele unterschiedliche Proteine

Das Ziel des Verbundprojekts ist es, für die Aufreinigung aller Proteine die gleichen Matrixmaterialien einzusetzen, was die Entwicklungskosten deutlich senken würde. Erreichen lässt sich dieses kostensparende Aufreinigungsverfahren, so die Idee, indem an die Proteine ein großes Polymer gebunden wird. Das hätte zur Folge, dass sich die Matrix nicht mehr für das kleine Protein, sondern für das große Polymer interessiert: Die Bindungseigenschaften für das Protein an eine Matrix – wichtige Voraussetzung für die Trennung – würden weitgehend über das Polymer definiert.

In einem ersten Schritt sollen die Proteine über eine einfache chemische Bindung mit Polyethylenglykol (PEG) verändert und über etablierte Verfahren aufgereinigt werden. Die Chromatographiematrix sollte dabei das Polymer hochaffin erkennen und binden können. Den Forschungspartnern aus Karlsruhe, Kaiserslautern und Stuttgart fallen grundlegende, biochemische und biophysikalische Forschungsarbeiten zum Bindungsverhalten des Polymers an das Protein zu.

Gelingt das Vorhaben, wären beträchtliche Kosten eingespart. Denn Proteine, die nicht wie Antikörper über Affinitätschromatographie gereinigt werden können, müssen in bis zu zehn Verfahrensschritten gereinigt werden. Damit ließe sich die Hälfte der Schritte und ein Drittel des Entwicklungsverfahrens einsparen.

Hoffnung auf rasche Integration in Herstellungsprozess

Einer relativ raschen Integration dieses standardisierten Aufreinigungsverfahrens in den Herstellungsprozess dürfte aufgrund des Erfahrungsschatzes mit pegylierten Proteinen nichts im Wege stehen, sagt Wagner. Die Chemie und die Bindungsphysik seien bekannt – die Pegylierung von Proteinen ist kein Neuland. Denn das wasserlösliche Polymer wird als Wirkstoffträger in der Pharmazie, in industriellen Anwendungen und in der zellbiologischen Forschung eingesetzt.

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