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Rasterfahndung nach Wirkstoff-Killern

Unerwünschte Substanzen wie Viren, Keime, Toxine in Biopharmazeutika und Medizinprodukten aufzuspüren gehört zum täglichen Geschäft des Labors Dr. Merk & Kollegen. Ferner entwickelt, produziert und vertreibt der mittelständische Betrieb seit fast 40 Jahren Diagnostika für die Humanmedizin, die zum großen Teil biotechnisch hergestellt werden. Die inzwischen auf über 40 Mitarbeiter angewachsene Firma benötigt selbst saubere Antigene und Proteine als Rohstoffe für die eigenen Diagnostika und hat deshalb ein gesteigertes Interesse an verbesserten Aufreinigungsverfahren.

In einem vom Bund geförderten Verbundprojekt legt das Unternehmen seine Erfahrung mit zwei Partnern aus der Region in die Waagschale, um die von biopharmazeutischen Herstellern gefürchteten Proteasen umfassender und noch in Spuren zu detektieren und effektiver vom therapeutischen Produkt zu trennen.

Höchste Ansprüche an Reinigung von Biotech-Wirkstoffen

Dr. Werner Dangel koordiniert das Verbundprojekt. © Pytlik

Die Firma, sagt ihr geschäftsführender Gesellschafter Werner Dangel, verfügt über spezielles Know-how in Biotechnik, Virologie, Zytotoxikologie und Mikrobiologie, das als Dienstleistung Herstellern von Biopharmazeutika und Medizinprodukten angeboten wird. Der Firmengründer und immer noch tätige Gesellschafter Dr. Walter Merk war Jahrzehnte in der Biotechnischen Forschung und Produktion in leitender Stellung bei Boehringer Ingelheim tätig. Das Labor weiß um die sehr hohen Sicherheitsansprüche der Kunden an die Reinigung biotechnisch hergestellter Wirkstoffe.

Wer wie biopharmazeutische Hersteller lebende Mikroorganismen, seien es Säugerzellen oder E.-coli-Bakterien als Wirkstoffproduzenten verwendet, muss bei deren Anzucht immer die Gefahr von Viren, Endotoxinen, Prionen oder störenden Proteasen einkalkulieren. Will er überprüfen, ob diese unerwünschten Bestandteile in seinem Aufreinigungsprozess sicher und erfolgreich entfernt wurden, muss er zur Überwachung sensitive und spezifische Bioassays als In-Prozess-Kontrolle und End-Kontrolle einsetzen.

Aufreinigung im Labormaßstab

In Ochsenhausen lässt sich der Aufreinigungsprozess im Labormaßstab unter GMP-Bedingungen nachbilden. © Pytlik

In unserem GMP- Prüflabor, erläutert der promovierte Biologe Dangel, kann der Aufreinigungsprozess (Filtration, Chromatographie usw.) des Herstellers im Labormaßstab nachgebildet werden. Durch aktives Zuführen von Viren in den zu reinigenden Wirkstoff und validierten Virusnachweismethoden, kann bei jedem einzelnen Aufreinigungsschritt die Effizienz der Virusabreicherung quantitativ gemessen werden.

Die oberschwäbische Firma besitzt hierfür eine Sammlung von Referenzstämmen mit über 100 Viren, Bakterien und Zellsystemen sowie alle erforderlichen Umgangsgenehmigungen nach Infektionsschutz-,Tierseuchen- und Gentechnikgesetz.

Im Fadenkreuz: Proteasen

Das aktuelle Verbundprojekt hat zum Ziel, ein Adsorberharz mit selektiven Affinitätsliganden zu entwickeln, um proteolytische Aktivität aus fermentierter Zellkulturlösung zu entfernen. Diese Proteasen will und muss jeder biopharmazeutische Hersteller im Aufreinigungsprozess entfernen, denn sie können größere Proteine wie therapeutische Proteine spalten.

Diese proteolytischen Enzyme kommen in Geweben und Zellen aller Organismen vor. Viele dieser Proteasen haben verschiedene pH-Optima und sind oft auch noch bei minus 20 Grad Celsius aktiv. Die Anwesenheit von Proteasen als Spurenkontaminanten im Endprodukt spielt im Hinblick auf Produktformulierung, Qualität und Stabilität des Biopharmazeutikums eine entscheidende Rolle, was die Hersteller dazu zwingt ihre therapeutischen Proteine aufwändig zu stabilisieren oder gefrierzutrocknen.
In enger Zusammenarbeit mit dem Experten Dr. Joachim Walter, der über 25 Jahre Berufserfahrung in der Entwicklung und Herstellung von biopharmazeutischen Proteinen aus Säugerzellkulturen hat, will die Ochsenhausener Firma die gewünschten Anforderungen an die Protease-Analytik und -Entfernung umsetzen.

Störenfriede beeinträchtigen Ausbeute

Im Grunde, erklärt Werner Dangel, spielen diese gefährlichen Störenfriede bei jedem Aufreinigungsprozess eine mehr oder weniger große Rolle, je nach Art des Biopharmazeutikums und des Aufreinigungsprozesses. Spätestens wenn die Zellen wie im Fall von bakteriellen Produktionsorganismen aufgeschlossen werden, um an den darin produzierten Wirkstoff zu gelangen, kommen diese potenziellen „Wirkstoffkiller“ mit dem Wirkstoff in Kontakt und beeinträchtigen seine Ausbeute.

Übliche Tests ungenau

Auf dem Markt erhältliche Tests, die Proteasen messen können, sind oft unspezifisch und schwanken erheblich in ihrer Nachweisgrenze. Und diese Tests unterscheiden nicht, welche Proteasen wie Pepsin, Trypsin oder Chymotrypsin sich noch im Medium befinden. Grundsätzlich, so Dangel, sei es möglich die proteolytischen Aktivitäten mit Hilfe von Proteasehemmern zu reduzieren. Deren Einsatz bei der Reinigung biopharmazeutischer Proteine sei jedoch wegen der zumeist hohen Toxizität der Inhibitoren nicht möglich.

Zwei Einsätze des Protease-Scavenger

Bislang wird die Abreicherung dieser unerwünschten Proteasen für jeden Reinigungsschritt aufwändig entwickelt. Das Verbundprojekt will dies ändern. Bereits vor der Reinigung in den diversen chromatographischen Säulen und am Schluss der Aufreinigung soll der Protease-Scavenger (Chromatographie-Säule = Scavenger) eingesetzt werden, der den Wirkstoff durchlässt und die Proteasen vollständig bindet.

Über den Erfolg entscheidet, ob es gelingt neue geeignete Protease“fänger“ zu selektionieren und diese im Scavenger zu halten. Diese Herausforderung will der Ulmer Chemiker Boris Mizaikoff meistern: Er muss Liganden finden, die hochspezifisch Proteasen binden und so an die Chromatographiematerialien koppeln, dass sie aus dem Scavenger nicht entweichen können. Wie diese Scavenger beschaffen sein müssen, lässt sich zu Beginn des Projektes, das eine Laufzeit von drei Jahren hat, noch nicht konkretisieren, erklärt Projektkoordinator Werner Dangel.

Das Ziel für die Protease-Analytik formuliert er so: „Wir wollen die entscheidenden drei, vier Proteasen erfassen“, die bei den biopharmazeutisch relevanten Säugerzellen wie CHO, NS0 und BHK eine zentrale Rolle spielen. „Wir wollen mit einem neuen Test sowohl den Proteasegehalt als auch das Proteasespektrum quantitativ und qualititativ erfassen.

Ziel: Hersteller spart kompletten Verfahrensschritt ein

Sind die Verbundpartner erfolgreich, könnte sich der biopharmazeutische Hersteller ein genaueres Bild von den in der Fermentationsbrühe befindlichen Proteasen machen. Dank des zu etablierenden Verfahrens wüsste er, welche Proteasen in welchem Reinigungsschritt noch auftauchen. Damit ließe sich eventuell ein kompletter Verfahrensschritt einsparen und das kostspielige Downstream Processing erleichtern. Mit einer hoch sensitiven Proteasetestung im Endprodukt ließen sich auch noch Spuren dieser „Wirkstoffkiller“ identifizieren und mit dem Scavenger entfernen. Und der Hersteller könnte sich im Rahmen der Produktstabilisierung eventuell die Gefriertrockung seines Wirkstoffes ersparen und auf die anwenderfreundlichere flüssige Formulierung umsteigen.

Drei Partner aus der Region wollen das auf drei Jahre angelegte Verbundprojekt stemmen. Unser Bild zeigt die Verteilung der Aufgaben. © Labor Dr. Merk & Kollegen

Ein Ziel, drei Partner: die Aufgabenverteilung

Die drei Projektpartner teilen sich die Aufgaben wie folgt. Das Labor Dr. Merk & Kollegen fermentiert die Säugerzellkulturen, stellt proteasehaltige Fermentationslösungen als Testmaterial bereit und entwickelt empfindliche Protease-Assays zur Identifizierung von Rest-Proteasen zur Überprüfung der Abreicherung von Proteasen. Des Weiteren soll der Protease-Assay helfen potenziell geeignete Liganden zu identifizieren. Auch die zytotoxische Prüfung geeigneter Liganden übernimmt das Labor, das die entwickelten Techniken schließlich auf ihre Anwendungsfreundlichkeit, Wirtschaftlichkeit und Effizienz bei Fermentation und Aufarbeitung im Labormaßstab prüft.

Der Chromatographie-Spezialist Atoll aus Weingarten (Landkreis Ravensburg), der Verbrauchsmaterialien für die Aufarbeitung und Reinigung von Proteinen herstellt und vor allem im Bereich der Biopharamazeutika vertreibt, bringt seine Kompetenzen im Bereich der Methodenentwicklung und Screening aller Arten von Chromatographiematerialien ein.

Im Verbundprojekt stellt die Atoll GmbH Screening-Werkzeuge mit gepackten Säulen im 96er-Mikrotiter-Platten-Format bereit. Atoll liefert fertig gepackte, charakterisierte und in der Produktion sofort einsetzbare Einmal-Säulen mit Chromatgraphiematerialien der meisten Hersteller. Anwendbar für Prozesse, bei denen eine Sanitisierungs-Validierung problematisch ist (z.B. bei Produkten wie dem geplanten Protease-Scavenger). Dies erspart die Packarbeit und bietet die Sicherheit, mit einer perfekt gepackten Säule zu arbeiten. Dr. Jürgen Friedle von Atoll bringt weit über 20 Jahre Erfahrung mit chromatographischen Trennmedien in das Projekt ein.

Einen wichtigen Part leistet auch der interdisziplinär arbeitende und projekterfahrene Ulmer Ordinarius Boris Mizaikoff vom Institut für Analytische und Bioanalytische Chemie. Sein Team wird biomimetische Rezeptormaterialien für Proteasen erforschen und entwickeln, die anschließend als synthetischer Ligand im molekular selektiven Protease-Scavenger oder im geplanten Protease-Assay eingesetzt werden können.

Protease-Testpackung für biopharmazeutische Hersteller

Bei erfolgreichem Abschluss des Verbundprojektes könnte das Ochsenhausener Labor Dr. Merk & Kollegen den biopharmazeutischen Herstellern eine Testpackung anbieten, die es ihnen erlaubt festzustellen, in welchen Aufreinigungsschritten und in welcher Menge Proteasen auftauchen und welche Proteasen dort auftreten. Damit wäre ein Protease-Test auf dem Markt, der nicht nur sensitiver ist, sondern auch das Spektrum der Proteasen erfasst. Und es gäbe eine Chromatographie-Säule (Scavenger) vom Kleinstmaßstab bis zum technischen Produktions-Maßstab, die Proteasen effizient abreichert, gleichzeitig aber alle biopharmazeutisch relevanten Wirksubstanzen passieren lässt.

Prinzipieller Vorteil: schonendes Aufreinigungsverfahren

Beim Design der geplanten Produkte wird ferner darauf geachtet, dass der spätere Anwender die einschlägigen GMP-Richtlinien erfüllen kann. Da Pharmahersteller zunehmend kritische Prozessschritte im Downstream auslagern, trägt sich das Ochsenhausener Unternehmen mit dem Gedanken, das Portfolio an Sicherheitsprüfungen zu erweitern und die Protease-Analytik oder sogar die Protease-Abreicherung als Dienstleistung anzubieten. Noch Zukunftsmusik, dennoch aber vorstellbar für Werner Dangel wäre die Möglichkeit, darauf aufbauend weitere neue Verfahren zu entwickeln um störende Substanzen mit unerwünschten Nebenwirkungen zu identifizieren und aus der Fermentationsbrühe oder dem Endprodukt zu entfernen, um Arzneimittel noch sicherer zu machen.

Grundsätzlich hat der von den Projektpartnern gewählte Weg den Vorteil, dass der Wirkstoff bei dem Verfahren von störenden Stoffen „befreit“ werde, was schonender als andere Aufreinigungsverfahren sei. Denn bei diesen wird der Wirkstoff erst an chromatographische Materialoberflächen gebunden, muss dann aber wieder zum Teil auch mit physikalischen Mitteln gelöst werden. Dies könnte problematisch sein, weil der Wirkstoff darunter leidet, sich umfalten kann und schlimmstenfalls zerstört wird. Deshalb brauche der Markt möglichst schonende Aufreinigungsverfahren, deren Maßstab sich gut vergrößern lässt.

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