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Rotes Licht beleuchtet Regulationsmechanismen der Genexpression

Das Zusammenspiel von Proteinen und der RNA ist ein zentraler Faktor bei der Regulation der Genexpression. Durch den Einsatz von Proteinen mit maßgeschneiderten chemischen Funktionen können diese Protein-RNA-Wechselwirkungen gezielt beeinflusst und im Zellinneren untersucht werden. Der Chemiker Moritz Schmidt befasst sich im Rahmen seiner Doktorarbeit an der Universität Konstanz mit der Einführung solcher Funktionen in Proteine durch den Einbau von nichtnatürlichen Aminosäuren. Er hat eine Technik entwickelt, mit der über rotes Licht zeitlich und räumlich kontrolliert Proteine mit ihren RNA-Bindungspartnern verknüpft werden können.

Moritz J. Schmidt wurde bereits für seine exzellenten Studienleistungen im Fach Life Science mit dem Hoechst-Doktorandenstipendium ausgezeichnet. © Moritz J. Schmidt

Die Eigenschaften einer Zelle werden über ihre spezifische Genexpression bestimmt. Diese ist also dafür verantwortlich, dass beispielsweise eine Leber- und eine Nervenzelle eines Organismus trotz gleicher genetischer Information so unterschiedlich sind. Ein zentraler Faktor in der Regulation der Genexpression sind Protein-RNA-Wechselwirkungen, da sie eine große Rolle bei Transkription, Reifung, Transport, Translation und Abbau von RNA spielen. „Oft sind die Bindungen zwischen Protein und RNA aber nicht von Dauer, sondern finden nur kurzzeitig unter bestimmten Bedingungen in einer Zelle statt. Eine Isolierung von RNA-Protein-Komplexen zur Untersuchung ist dann nicht möglich“, erklärt Moritz Schmidt.

Nach seinem sehr guten Bachelor-Abschluss im Fach Life Science an der Universität Konstanz wurde Moritz Schmidt dort in das sogenannte Fast-Track-Programm aufgenommen, das ihm den Direkteinstieg in die Doktorarbeit ohne Anfertigung einer Masterarbeit erlaubte. Dazu forscht er nun in der Arbeitsgruppe von Dr. Daniel Summerer im Fachbereich Chemie an Systemen, um in lebenden Zellen Proteine mit maßgeschneiderten, nichtnatürlichen Eigenschaften zu exprimieren und so Einfluss auf ihre biologische Funktion zu nehmen. So ist es ihm beispielsweise gelungen, eine Technik zur kovalenten Verknüpfung eines Proteins mit seinem RNA-Bindungspartner zu entwickeln und damit einen Nachweis der Wechselwirkungen unter physiologischen Bedingungen zu ermöglichen.

Zur Expression von Proteinen mit maßgeschneiderten chemischen Funktionen werden künstliche, nicht-kanonische Aminosäuren eingesetzt. Diese unterscheiden sich von den 20 sogenannten kanonischen Aminosäuren dadurch, dass sie natürlicherweise nicht durch Basentripletts, also dreistellige Basen-Codons in der DNA und RNA codiert werden. Über eine Erweiterung des genetischen Codes können aber auch nicht-kanonische Aminosäuren in Ribosomen in Proteine eingebaut werden. Dabei wird anstelle eines Stop-Codons in der mRNA der Einbau einer unnatürlichen Aminosäure durch eine spezielle Transfer-RNA (tRNA) im Ribosom gewährleistet. Die tRNA wird von ihrer zugehörigen Aminoacyl-tRNA-Synthetase mit der nicht-kanonischen Aminosäure beladen und fungiert dann als Adaptermolekül, das den Einbau der Aminosäure an der richtigen Stelle vermittelt und in diesem speziellen Fall gezielt ein Stop-Codon erkennt. Diesen Vorgang macht sich auch Moritz Schmidt für das gezielte Proteindesign zunutze. „Die nichtnatürliche Aminosäure wird bei der Translation über eine spezifische tRNA zum Beispiel an Stelle eines Stop-Codons ins Protein eingebaut“, schildert Schmidt.

Maßgeschneiderte Werkzeuge für gezieltes Proteindesign

Voraussetzung für den ortsspezifischen Einbau einer nicht-kanonischen Aminosäure sind die erwähnten zusätzlichen Translationskomponenten, die in die Zelle bzw. in den ganzen Organismus eingeführt werden. Zum einen wird eine spezielle Aminoacyl-tRNA-Synthetase benötigt. Diese Enzyme sind jeweils spezifisch für eine Aminosäure und beladen nur die dazugehörige tRNA. „Somit wird also ein zusätzliches Paar einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase und tRNA benötigt, das keine Kreuzreaktionen mit den bereits vorhandenen Translationskomponenten eingeht und das künstliche Aminosäuren als Substrat erkennt und prozessiert“, erklärt Moritz Schmidt.

„Das hier verwendete Synthetase/tRNA-Paar stammt aus einem bezüglich der verwendeten Organismen evolutionär weit entfernten Organismus. Damit ist sichergestellt, dass die Synthetase keine anderen Aminosäuren erkennt, und dass die tRNA nicht von einer anderen, zellulären Synthetase als Substrat verwendet wird“, erläutert Schmidt. Um eine Synthetase zu finden, die eine neue nichtnatürliche Aminosäure selektiv erkennt, werden riesige Synthetase-Bibliotheken gescreent, die bis zu 1 Milliarde Mutanten enthalten. Die Selektion erfolgt über ein Reporterkonstrukt (z.B. eine Antibiotika-Resistenz), das die Fähigkeit zur Unterdrückung des Stop-Codons mit der Überlebensfähigkeit in Anwesenheit eines Antibiotikums koppelt.

Kontrollierte Verknüpfung durch rotes Licht

Im Rahmen seiner Dissertation entwickelt Moritz J. Schmidt Systeme für die einfache Expression von Proteinen und Peptiden mit maßgeschneiderten chemischen Funktionen direkt in lebenden Zellen. © Moritz J. Schmidt

Damit die Verknüpfung des Proteins mit einem RNA-Bindungspartner auch räumlich und zeitlich gesteuert werden kann, wird sie erst durch Bestrahlung mit rotem Licht ausgelöst. „Das rote Licht regt eine lichtaktivierbare Substanz an, einen sogenannten Photosensibilisator, der vor der Bestrahlung zugegeben wird. Der angeregte Sensibilisator wiederum löst eine Oxidation der Aminosäure in eine reaktive Spezies durch Sauerstoff aus, die dann als Photovernetzer dient“, erläutert Schmidt das Prinzip. Im oxidierten Zustand bildet die Aminosäure bevorzugt mit Nukleobasen in ihrer Nähe stabile, kovalente Bindungen aus. Dadurch können transiente Wechselwirkungen fixiert und somit besser erkannt und untersucht werden. Ebenso könnte im Prinzip dadurch Einfluss auf die Expression eines Gens genommen und die Folgen einer derartigen Deaktivierung könnten betrachtet werden.

Anwendungen in Medizin und Pharmazie möglich

Die meisten bisher verwendeten genetisch kodierten Photovernetzer wurden zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt. Die hierfür verwendeten Photochemien basieren auf der Bestrahlung mit UV-Licht, welches nur eine sehr geringe Penetrationstiefe zeigt, was die Anwendung in Gewebe erschwert. Zudem kann UV-Licht-Bestrahlung zu DNA-Schädigungen und anderen negativen Effekten in den bestrahlten Proben führen. „Rotes Licht dagegen schädigt bestrahlte Zellen nicht und zeichnet sich darüber hinaus durch eine hohe Penetrationstiefe aus, wodurch es potenziell für Anwendungen in Gewebe besser geeignet ist“, berichtet Schmidt.

Es wird heutzutage bereits in der Medizin in der photodynamischen Therapie eingesetzt, um Tumoren und andere Gewebeveränderungen wie beispielsweise Gefäßneubildungen mit Licht und speziellen Photosensibilisatoren zu behandeln. Die Forschung von Moritz J. Schmidt kann hier zur Entwicklung neuer proteinbasierter Medikamente für die photodynamische Therapie beitragen. Und auch weitere Anwendungsmöglichkeiten sind durchaus denkbar, wie Moritz Schmidt aufzeigt: „Interessant wäre der Einsatz im Bereich der Entwicklung pharmazeutischer Wirkstoffe, die gezielt an bestimmten Nukleinsäuren angreifen.“

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