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TET Systems: Kontrollierte Genexpression bei Eukaryonten

Das am weitesten verbreitete und erfolgreichste System zur experimentellen Regulation der Genexpression in Eukaryonten beruht auf einem Genschalter, der in Bakterien die Resistenz gegen Tetracyclin reguliert. Die Tet-Technologie gibt dem Forscher ein Werkzeug an die Hand, mit dem er gezielt die Aktivität einzelner Gene spezifisch, quantitativ und reversibel in vivo oder in vitro kontrollieren kann. Das Heidelberger Unternehmen TET Systems vermarktet die Lizenzen für die inzwischen für viele unterschiedliche Funktionen modifizierte und optimierte Tet-Technologie weltweit.

Wenn man die Funktionsweise eines Gens in der Zelle oder im ganzen Organismus verstehen will, muss man seine Expression experimentell kontrollieren können. Das heute meist verwendete experimentelle Regulationssystem der Genexpression bei Eukaryonten ist die Tet-Technologie, die auf dem genetischen Schaltkreis aufbaut, der in Bakterien die Resistenz gegen das Antibiotikum Tetracyclin reguliert.

TET Systems

Die von Hermann Bujard und Mitarbeitern am Zentrum für Molekulare Biologie Heidelberg (ZMBH) seit Anfang der 1990er Jahre entwickelte Tet-Technologie wurde so adaptiert und optimiert, dass das bakterielle Schaltsystem auch in Eukaryonten - in einer großen Zahl von Zellkultursystemen (darunter menschliche Tumorzelllinien und pluripotente Stammzellen) und Organismen (von einzelligen Pilzen und Parasiten wie Plasmodium und Toxoplasma über Nematoden und Insekten bis hin zu Pflanzen, Fischen, Amphibien und Säugetieren, insbesondere Mäusen) - willkürlich Gene an- und abschalten kann. Die Tet-Technologie erlaubt eine äußerst wirksame, präzise und reversible Kontrolle sowohl über den Zeitpunkt als auch über den Grad der Genexpression in Eukaryontensystemen. Ihr riesiges Anwendungspotenzial wird durch bis jetzt weit über 7.000 Veröffentlichungen in führenden Fachzeitschriften belegt.

Alleiniger Inhaber der durch ein breites Patentportfolio weltweit geschützten Tet-Technologie ist die von Bujard und Kollegen in Heidelberg gegründete Firma TET Systems GmbH & Co. KG. Sie erteilt die Lizenzen für die Tet-Technologie und ihre Komponenten sowie für ihre Modifikationen und Verbesserungen. Akademische Institutionen erhalten die Lizenz automatisch mit dem Kauf der Komponenten der Tet-Technologie kostenfrei, sofern sie nur für akademische Forschung eingesetzt werden.

Dr. Ernst Boehnlein © TET Systems
Von der kostenfreien Lizenz ausdrücklich ausgenommen sind Projekte, die von gewinnorientierten Institutionen bezahlt werden, wie Dr. Ernst Boehnlein, CEO der TET Systems, erklärt, und natürlich ist auch der Verkauf oder die anderweitige Weitergabe der Tet-Komponenten an Dritte ausgeschlossen.


Für Unternehmen und andere Profitorganisationen bietet TET Systems kommerzielle Lizenzen oder nicht-exklusive Forschungslizenzen für den Zugang zur Technologie an. Die Lizenzvereinbarungen werden an den Bedarf des Lizenznehmers angepasst. TET Systems verfügt über ein Netzwerk von Lizenzpartnern, über die Komponenten der Tet-Technologie und verwandte Produkte und Dienstleistungen erworben werden können. Zu diesem Netzwerk kommerzieller Lizenzgeber gehört auch Clontech (heute Teil von Takara Bio), die seit über 15 Jahren die Tet-Technologie als bevorzugter Partner vermarktet und vertreibt.

Vom bakteriellen zum eukaryotischen Regelkreis

Formel Doxycyclin

Damit eine Transkription des einklonierten Gens im Eukaryontensystem möglich ist, wird ein Promotor vorgeschaltet, der einen Polylinker für dasjenige Gen enthält, dessen Aktivität gezielt reguliert werden soll. Als Induktor wird heute meist das Tetracyclin-Derivat Doxycyclin verwendet, dessen chemische und physiologische Eigenschaften auf molekularer Ebene gut verstanden sind. Doxycyclin hat den Vorteil, dass es in nahezu alle Zellen leicht diffundieren und sogar die Blut-Hirn-Schranke und die Plazenta passieren kann. Außerdem wirkt es hervorragend gegen intrazelluläre Pathogene und ist in den verwendeten Konzentrationen für Eukaryontenzellen nicht toxisch. Bereits drei Nanogramm Doxycyclin pro Kubikzentimeter reichen für eine komplette An- oder Abschaltung des Gens aus. Durch einfache Änderung der Doxycyclin-Konzentration lässt sich aber die Genaktivität über einen Bereich von mehr als fünf Zehnerpotenzen stufenlos regulieren.

Das Tet-System® für das seit seiner Erstbeschreibung zahlreiche, für verschiedene Anwendungsbereiche adaptierte Modifikationen entwickelt worden sind, leitet sich aus dem Tetracyclinresistenz-Operon von E.coli ab. Dessen Transkription wird in Abwesenheit von Tetracyclin durch den Tet-Repressor inhibiert und erst durch Bindung des Antibiotikums an den Repressor aktiviert. Bujard und Mitarbeiter fusionierten nun den Tet-Repressor mit der VP16-Aktivierungsdomäne von Herpes simplex, wodurch der Repressor in einen Aktivator der Transkription überführt wurde. Das Hybridprotein wird als Tetracyclin-abhängiger Transaktivator (tTA) bezeichnet und ist auf einem der beiden Vektoren des Tet-Expressionssystems kodiert. Der zweite Vektor enthält eine multiple Klonierungsstelle für das zu klonierende Zielgen, dessen Aktivität durch Tetracyclin kontrolliert wird. In Abwesenheit von Tetracyclin oder Doxycyclin wird das einklonierte Gen transkribiert, bei Zugabe des Antibiotikums wird das Ablesen des Gens verhindert („Tet-Off"-Variante). Für den Einsatz in Eukaryonten wird heute in aller Regel eine „Tet-On"-Variante verwendet, bei der eine Transkription des Gens erst nach Zugabe von Doxycyclin erfolgt. Hierzu wurde durch Einführung von Mutationen in das Hybridprotein aus Tet-Repressor und viraler Aktivierungsdomäne ein reverser Tetracyclin-kontrollierter Transaktivator (rtTA) erzeugt, der eine Genexpression nur in Anwesenheit von Doxycyclin erlaubt.

Die Möglichkeit, mit Hilfe der Tet-Technologie wahrhaft „konditionale Mutanten" herzustellen, also Zellen oder ganze Organismen, bei denen die Mutation erst wirksam wird, wenn Tetracyclin oder Doxycyclin zugegeben („Tet-On"-Schalter) oder entzogen („Tet-Off"-Schalter) wird, eröffnet vielfältige Perspektiven zur Analyse von Genfunktionen und zur Entwicklung neuer Tiermodelle für menschliche Krankheiten. „Gene können jetzt in einer zelltypspezifischen und zeitlich definierten Weise reversibel nicht nur an- oder abgeschaltet werden, sondern auch auf eine intermediäre Aktivität eingestellt werden, die den pathologischen Verhältnissen beim Menschen eher entspricht als die „Alles-oder-Nichts"-Schaltung", erklärt Dr. Sabine Freundlieb, Manager Scientific Affairs der TET Systems und frühere Mitarbeiterin von Bujard am ZMBH.

Malaria-Bekämpfung durch Tet-Technologie

Larven von Aedes aegypti, die mit dem RIDL-System und einem Fluoreszenzmarker modifiziert worden sind. © Oxitec UK

Das britische Biotech-Unternehmen Oxitec (Oxford Insect Technologies) hat den Tet-Schalter verwendet, um eine elegante Methode zur Bekämpfung von Moskitos als Seuchenüberträger zu entwickeln, die sogenannte RIDL®-Technologie. Eingesetzt wurde sie zunächst gegen Mücken der Gattung Aedes, die Überträger von Dengue-Fieber und Gelbfieber sind - zwei von Arboviren ausgelöste Krankheiten warmer Länder, von denen jährlich über 100 Millionen Menschen betroffen sind. Inzwischen ist diese Technologie auch auf Anopheles-Mücken, die Überträger der Malaria, angewandt worden. RIDL-Insekten tragen ein mit einem Tet-Schalter versehenes Transgen, das auf die Nachkommen vererbt wird und bewirkt, dass die Larven absterben. Wenn männliche RIDL-Mücken freigesetzt werden, um sich mit Wildtyp-Weibchen zu paaren, verhindern sie durch diese „Geburtskontrolle" die Vermehrung. Durch das Tet-System wird das Lethalitätsgen konditional; es kann abgeschaltet werden, um große Mengen von Insekten zu züchten.

Tet-Mäuse als Modelle

Mäuse, die das Indikatorgen Luziferase unter Tet Kontrolle gewebespezifisch exprimieren. © K.Schönig, ZMBH
Inzwischen sind annähernd 300 verschiedene Tet-transgene Mauslinien beschrieben worden, von denen viele für die akademische Forschung bei den einschlägigen Maus-Archiven wie The Jackson Laboratory in den USA, RIKEN in Japan und EMMA (das Europäische Maus Mutanten Archiv) in Europa erhältlich sind. Mit solchen Mausmodellen lassen sich molekulare Ereignisse bei der Entstehung und der Progression eines Krankheitsbildes ebenso untersuchen wie seine mögliche Reversibilität oder Rückbildung. Nicht nur können Gene und ihre Produkte als pharmakologische Targets identifiziert werden, die Tet-Mäuse eignen sich auch hervorragend für präklinische ADME/Tox-Studien. Konditionale Mausmodelle, bei denen man die Expression von Oncogenen wie c-myc, ras 12 oder ErbB2 strikt unter Tet-Kontrolle gestellt hatte, haben neue unerwartete Erkenntnisse über die Mechanismen erbracht, welche die Tumorinitiation, -progression und –regression steuern. Danach scheinen viele Tumoren nicht nur für ihre Entstehung, sondern auch für ihr weiteres Wachstum auf die von dem Tumor-initiierenden Onkogen ausgelösten Expressionsmuster angewiesen zu sein – ein Phänomen, das als konstitutive Onkogen-Abhängigkeit („oncogen addiction“) bezeichnet wird. Bei einer Mauslinie, die als Modell der menschlichen Chorea Huntington (CH), einer unheilbaren neurodegenerativen Erbkrankheit, dient, wurde die krankheitsauslösende Mutante eines chimärischen Maus/Mensch-Huntingtin-Gens unter Tet-Kontrolle gestellt. Die bei der Expression dieses Huntingtin-Gens auftretenden, für CH typischen neuropathologischen Veränderungen, die zu schwerer progressiver Muskeldystrophie führten, konnten durch Abschalten dieses Gens rückgängig gemacht werden. Dieser spektakuläre Befund weckt die Hoffnung, dass in der Zukunft selbst für solche verheerenden, anscheinend unaufhaltsam fortschreitenden Krankheiten eine kausale Therapie gefunden werden kann. Selbstverständlich sind für eine somatische Gentherapie solcher Krankheiten zuverlässige Genschalter, wie sie die Tet-Technologie bereithält, unabdingbar.

Ein neuer Ansatz zur Behandlung von Diabetes

In einer kürzlich publizierten Studie wurde gezeigt, dass bei transgenen Mäusen, bei denen die Insulin produzierenden β-Zellen des Pankreas vollständig zerstört worden waren - und die nur durch externe Insulingaben überlebten -, nach einiger Zeit die benachbarten α-Zellen in den Langerhans-Inseln des Pankreas - die normalerweise das antagonistische Hormon Glucagon sezernieren - die Produktion von Insulin übernahmen. Die Ergebnisse eröffnen der Forschung neue Perspektiven zur kausalen Therapie von Typ-1-Diabetes.

Um die Herkunft dieser neuen Insulin produzierenden Zellen aus α-Zellen sicher nachzuweisen, unternahmen Herrera und seine Mitarbeiter an der Universität Genf sorgfältige Analysen der Zelllinien, für die der Einsatz des „Tet-On Advanced System“ ausschlaggebend war. Dazu erklärte Boehnlein: „Diese Publikation ist ein weiteres eindrucksvolles Beispiel dafür, wie man bereits etablierte Tet-transgene Mäuse einem „Recycling“ unterwerfen kann, um Mäuse mit multiplen Transgenen herzustellen, die man braucht, um so komplexe wissenschaftliche Fragestellungen zu beantworten.“

Seiten-Adresse: https://www.gesundheitsindustrie-bw.de/fachbeitrag/aktuell/tet-systems-kontrollierte-genexpression-bei-eukaryonten