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Tröpfchen für Tröpfchen – Nanodosierung in bester Qualität

Am Fraunhofer IPA in Stuttgart wurde ein neues Verfahren zur automatisierten Dosierung von Flüssigkeiten im Mikro- und Nanobereich entwickelt. Das „i-doT“-System kommt ohne Pipettenspitzen aus, eignet sich für Hochdurchsatzverfahren und funktioniert berührungs- und damit kontaminationsfrei. Über exakt dosierbare Druckstöße werden Tröpfchen durch Öffnungen in Mikrotiterplatten gepresst.

Diese Mikroarrays wurden mit dem I-doT-System "gedruckt". © Fraunhofer IPA

Der Trend bei Mikrotiterplatten ging aus Kostengründen zu immer mehr Vertiefungen (Wells) pro Platte: Nach den 96-Well-Platten kamen zügig auch 384- und danach 1.536-Well-Platten auf den Markt. Die Probenvolumina haben sich damit reduziert, liegen aber selbst bei den 1.536-Well-Platten meist noch über fünf Mikrolitern. Da gerade bei Hochdurchsatzverfahren in der Biotechnologie die Kosten mit den Volumina exorbitant in die Höhe schnellen können, sind neue Ansätze zu Nanodosierverfahren gefragt. Neben der Dosiergenauigkeit kommt es dabei auf eine sterile und kreuzkontaminationsfreie Probenabgabe an.

Mit diesen Anforderungen gingen Dipl.-Ing. Tobias Brode und Dipl.-Ing. Andreas Traube vom Fraunhofer-Institut für Produktionstechnik und Automatisierung IPA an die Entwicklung von i-doT (immediate drop on demand technology). Die beiden Ingenieure – Brode hat in Berlin Mikrosystemtechnik studiert und Traube in Stuttgart Maschinenbau – haben sich gründlich in biotechnologische Verfahren eingearbeitet. Dabei half der gute Kontakt vor Ort zu Biotech-Spezialisten vom Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik IGB. „Wir verstehen uns inzwischen als eine Art ‚Bioneer’, als Vermittler zwischen Biologie und Ingenieurwesen mit einer Portion Pioniergeist“, sagt Brode.

„Bioneering“ erleichtert die Laborarbeit

Die zündende Idee der beiden Forscher waren winzige Bohrungen in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten. Die Bohrungen sind so klein, dass die in ihnen wirkenden Kapillarkräfte die Öffnung unter normalem Füllstandsdruck abdichten. Wenn jedoch von oben ein Druckluft-Stoß ausgeübt wird, werden die Kapillarkräfte kurzzeitig überwunden: Aus der Öffnung tritt wie aus einer Düse ein winziger Tropfen aus. Bis zu 400 Tropfen pro Sekunde können auf diese Weise erzeugt werden, versichern die Entwickler. Je nach Düsendurchmesser werden verschiedene Tropfenvolumina erreicht. Düsen mit einem Durchmesser von 110 Mikrometern liefern je nach Druckstoß Tropfen von vier bis sieben Nanolitern. Aktuell hat das Team den Düsendurchmesser auf 70 Mikrometer reduziert, um Tropfen mit einem Volumen von nur einem Nanoliter zu erzeugen.

Funktionsprinzip des berührungs- und damit kontaminationsfreien i-doT-Dosiersystems. © Fraunhofer IPA

„Entscheidend für reproduzierbare Tropfenvolumina ist die Düsenqualität. Im Stroboskop sieht man bereits, ob die Tropfen in ihrer Größe homogen sind. Unsere Fehlerrate bei der Dosiergenauigkeit liegt unter zwei Prozent pro Einzel-Well. Damit liegen wir nicht schlechter als Pipetten, und die arbeiten meist in größeren Volumenbereichen“, erklärt Brode. Mit diesen Werten ist i-doT eine echte Alternative zu herkömmlichen Pipettierrobotern und bietet deutliche Vorteile bei Kosten und Handhabung: Es müssen keine Pipettenspitzen gereinigt oder ausgetauscht werden, i-doT-Platten sind einfach herzustellen und deshalb kostengünstige Einmalprodukte. Einsetzbar wären sie zum Beispiel bei Wirkstoff-Screenings: „Bis zu 300.000 Tests pro Tag könnten mit i-doT im Hochdurchsatzverfahren durchgeführt werden“, so Brode.

Von Platte zu Platte mit hohem Durchsatz

Tropfenablösung per Druckstoß. © Fraunhofer IPA

Auch für Mikroarrays eignet sich die neue Technik. „Wir konnten nachweisen, dass es bei Spotabständen bis hinunter zu 400 Mikrometern keine Verschleppungen gibt. Damit sind Abstände im Millimeter-Bereich erst recht kein Problem und wir können mit i-doT auch Arrays auf Slides oder in Mikroliter-Platten drucken.“ Bei manchen Problemfällen wie sehr viskosen Lösungen oder solchen mit schwer löslichen Komponenten hat sich i-doT gegenüber Pipetierrobotern bereits als das robustere System erwiesen: „Bei Proteinlösungen zum Beispiel kommt es immer wieder vor, dass einzelne Bestandteile ausfällen. Oder es ändern sich die Oberflächenspannung und die Viskosität der Lösung. Das ist bei i-doT jedoch nicht so gravierend wie bei Pipettiersystemen“, sagt Brode. Je nach Viskosität der Lösung können bei i-doT theoretisch zwar Satelliten-Tropfen entstehen, über die Minimierung der Düsendurchmesser wird diese Gefahr jedoch gebannt, wie Brode erklärt: „Je kleiner der Öffnungsdurchmesser, um so besser ist die Energieübertragung an den Tropfen. Das heißt, der Bereich, in dem der richtige Druck zu wählen ist, wird toleranter und das System damit einfacher zu bedienen.“

Selbst Zellen können mit i-doT übertragen werden. „Es ist uns bereits gelungen, mit i-doT einen gleichmäßigen Zellrasen zu erzeugen“, bestätigt Brode. Ob HeLa-Zellen, Fibroblasten oder Keratinozyten: Bisher ließen sich alle ausprobierten Zelllinien gut dosieren und zeigen auch danach eine gute Proliferation. „Wir konnten keinerlei Beeinträchtigung feststellen“, sagt Brode. Eine interessante Fragestellung und Herausforderung ist die Kombination mit einer Zellsortier- und Zählvorrichtung. „Man könnte eine Mikrokamera und einen Laser in Düsennähe anbringen und die Düsen für Sortiervorgänge entsprechend modifizieren. Von der Steuerungsseite her ist das machbar, aber wir müssen noch untersuchen, inwieweit es auf Einzelzell-Niveau funktioniert“, so Brode. „Es gibt unglaublich viele Ideen, die zurzeit wachsen“, sagt er selbst zu den Zukunftsaussichten.

i-doT als Basistechnologie aufstellen und dann wirtschaftlich nutzen

Zurzeit wird an i-doT noch kräftig weitergearbeitet, bevor das Entwickler-Duo das System über eine eigene Firma auf den Markt bringen wird. „Wir sind im Moment in der komfortablen Position, dass wir unter dem Dach von Fraunhofer weiterforschen können, um die Technologie und die Geräte zu optimieren“, so Brode. Seit am 9. Februar 2010 auf dem IPA-Gelände das neue Bioproduktionslabor BioPoLiS eröffnet wurde, steht es auch dem i-doT-Team für seine Arbeiten zur Verfügung und wird den weiteren Fortschritt noch beschleunigen, wie die beiden vermuten: „BioPoLiS bietet die perfekte Umgebung, um i-doT weiterzuentwickeln. Wir können hier steril arbeiten, haben eine gesicherte Druckluftversorgung und genügend Platz, um unsere Ideen auszuprobieren und auszuloten, wo eventuell noch Schwächen sind.“

Auch das bisher Geleistete hat dem Team bereits Erfolge beschert: Brode und Traube nahmen am Science2Start-Wettbewerb der BioRegio STERN Management GmbH teil und gewannen mit i-doT 2009 den zweiten Preis. Der Wettbewerb motiviert und unterstützt Forscher dabei, mit ihren Ideen ein eigenes Unternehmen zu gründen. Brode und Traube haben dafür einen Fahrplan erstellt, den sie bei aller Begeisterung für die guten Arbeitsbedingungen am IPA energisch weiterverfolgen. „Wir befassen uns bereits mit Anfragen aus der Industrie und werden im Laufe dieses Jahres die ersten kommerziellen Anwendungen präsentieren. Bis zum nächsten Jahr wollen wir unseren Business-Plan entwickeln und bis 2012 alles so weit dingfest machen, dass wir das Unternehmen starten können“, sagt Brode.

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