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Ultraschnelle STED-Nanoskopie

Der Nobelpreisträger Stefan Hell hat mit seinem Team am DKFZ einen weiteren Durchbruch in der höchstauflösenden Lichtmikroskopie erzielt: die Entwicklung eines ultraschnellen STED-Nanoskops. Damit können erstmals molekulare Prozesse und Transportvorgänge in lebenden Zellen in Zeitschritten von Millisekunden direkt beobachtet werden.

Nobelpreisträger Stefan Hell. © Helmholtz-Gemeinschaft

In seiner Eröffnungs-Lecture der Lindauer Nobelpreisträgertagung am 29. Juni 2015 berichtete Stefan Hell über ein in seinem Labor für Optische Nanoskopie am Heidelberger Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) entwickeltes STED-Nanoskop. Mit diesem können Aufnahmen in zeitlichen Abständen von Millisekunden gemacht werden. Dadurch wird es nun möglich, schnell ablaufende dynamische Vorgänge im Nanometerbereich, beispielsweise Vesikelfusionen oder den Transport von Viren und Biomolekülen in lebenden Zellen, direkt zu  verfolgen. Stefan Hell hatte 2014 den Nobelpreis für Chemie für die Entwicklung der STED-Mikroskopie („Stimulated Emission Depletion Microscopy") erhalten, die eine räumliche Auflösung der Lichtmikroskopie über die durch die Abbe'sche Formel gesetzte Beugungsgrenze hinweg ermöglicht. Dadurch können Objekte in einer Größenordnung von wenigen Nanometern (die zuvor nur im fixierten, leblosen Zustand mit dem Elektronenmikroskop sichtbar gemacht werden konnten) mit Fluoreszenzlicht im intakten Lebendzustand beobachtet werden. (Wir haben darüber in diesem Portal berichtet: Entwicklung und Anwendung der hochauflösenden STED-Mikroskopie).

Ein ultraschneller elektrooptischer Scanner

Ultraschnelle STED-Nanoskopie von EGFP-markierten Vesikeln im Neuron der lebenden Larve von Drosophila. Zeitliche Auflösung 8 Millisekunden. In der „Nature Methods“-Publikation ist das Video hierzu gezeigt. © Jale Schneider und Jasmin Zahn, Optische Nanoskopie, DKFZ

Für Stefan Hell lag es nahe, nach der räumlichen Höchstauflösung nun auch eine zeitliche Auflösung über alle bisherigen Grenzen hinweg anzustreben. Dabei waren allerdings enorme technische Herausforderungen zu überwinden. Mit schnellen Scannern für Laserrastermikroskope und schnellen Kameras für die Weitfeldmikroskopie war es zwar möglich, die Zeitauflösung auf weniger als hundert Millisekunden zu erhöhen, doch war damit die räumliche Auflösung zu gering, um subzelluläre Vorgänge im Nanometerbereich zu beobachten. Bei der STED-Technik können Weitfeldbeleuchtung und schnelle Kameras nicht eingesetzt werden, da die Probe mit zwei Lasern unterschiedlicher Wellenlänge (einem für die Anregung und einem für die Auslöschung der Fluoreszenz) Punkt für Punkt abgerastert wird. Die Scanner müssen eine von den Wellenlängen unabhängige Strahlablenkung gewährleisten. Auch muss die Verweildauer des Laserstrahls auf jedem Pixel des Bildfeldes um Größenordnungen reduziert werden, um ein zu starkes Fotobleichen der fluoreszierenden Probe zu verhindern.

Jale Schneider © privat

Technisches Kernstück der jetzt in der Zeitschrift „Nature Methods" veröffentlichten STED-Nanoskopie mit einer Zeitauflösung im Millisekundenbereich war die Entwicklung eines ultraschnellen elektrooptischen Scanners durch die Diplom-Ingenieurin Jale Schneider. Sie nennt als die entscheidenden Elemente des im Rahmen ihrer Doktorarbeit an der RWTH Aachen entwickelten Scannersystems eine schnelle Strahlablenkung, eine schnelle Detektionseinheit und ein FPGA („Field Programmable Gate Array") basiertes Steuerungs- und Datenverarbeitungssystem. Die Pixel-Verweildauer des Strahls konnte so auf 6,25 Nanosekunden pro Frame und damit bis an die Grenze der Fluoreszenzlebensdauer verkürzt werden. Proportional dazu steigt die Bildrate. Die aufgenommenen Frames werden stochastisch (das heißt als zeitlich geordnete zufällige Vorgänge) aufaddiert, bis das Signal die gewünschte Stärke erreicht hat; das Bildfeld wird also nicht einmal langsam, sondern zur Reduktion des Fotobleichens mehrfach und schnell abgetastet.

Anwendungen für die Zellbiologie

Stefan Hell und sein Team in der Abteilung Optical Nanoscopy am DKFZ. Rechts vorn, vor Stefan Hell, sitzt Johann Engelhardt und neben ihm Jale Schneider. © DKFZ

Im  Labor für „Optical Nanoscopy" am DKFZ entstand unter der Leitung von Stefan Hell und Johann Engelhardt aus Jale Schneiders Scannersystem das bei Weitem schnellste Nanoskop der Welt. Die hohe zeitliche Auflösung – mehrere tausendmal schneller als mit herkömmlichen Laserrastermikroskopen – erlaubt, dynamische Vorgänge innerhalb der Zelle im Detail zu erkennen, die sich bisher einer optischen Analyse entzogen haben. In Zusammenarbeit mit Stephan Sigrist und seinem Team von der Freien Universität Berlin konnten die Forscher die Bewegungen einzelner Neuropeptid-transportierender Vesikel in den Nervenzellen einer lebenden Drosophila-Larve mit einer sich aus der Online-Addition ergebenden Zeitauflösung von acht Millisekunden verfolgen; die ursprüngliche Bildrate war noch viermal höher.

Als weiteres Anwendungsbeispiel beobachteten die Forscher AIDS-Viruspartikel (HI-Viren, die mit „enhanced green fluorescent protein", EGFP, markiert waren) vor und während ihrer Aufnahme durch die Zelle. Diese Experimente erfolgten in der Virologie des Universitätsklinikums Heidelberg in Kooperation mit Hans-Georg Kräusslich und seinen Mitarbeitern, die schon seit Jahren intensiv die STED-Nanoskopie in der AIDS-Forschung einsetzen. So hatten die Virologen mit dieser Technik nachgewiesen, dass sich bei den HI-Viren bestimmte Hüllproteine zusammenlagern müssen, um die Wirtszelle zu infizieren ("Erst mit ihrer Andockstelle sind AIDS-Viren infektiös"). Mithilfe des von Stefan Hell und seinem Team entwickelten ultraschnellen STED-Nanoskops wird nun auch die zeitliche Analyse der molekularen Vorgänge der Virusinfektion möglich, die zu neuen Angriffspunkten für eine dauerhafte AIDS-Therapie führen könnte.

Originalpublikation:
Schneider J, Zahn J, Maglione M, Sigrist SJ, Marquard J, Chojnacki J, Kräusslich H-G, Sahl SJ, Engelhardt J, Hell SW: Ultrafast, temporally stochastic STED nanoscopy of millisecond dynamics. Nature Methods (2015) doi:10.1038/nmeth.3481

Seiten-Adresse: https://www.gesundheitsindustrie-bw.de/fachbeitrag/aktuell/ultraschnelle-sted-nanoskopie