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Upstream und Downstream Processing im Einklang

Wie im laufenden Jahr ist bei der Trenzyme GmbH auch für 2010 ein weiterer Ausbau des Downstream Processing-Bereichs geplant. Dabei ist die Proteinreinigung beim biotechnologischen Dienstleister aus Konstanz oft Teil eines Komplettpaketes, das von der Klonierung des Gens über die Expression des Proteins bis hin zu dessen Reinigung und Analyse reicht. Wie Dr. Christoph Glanemann, Projektmanager und Leiter der Downstream Processing Unit des Unternehmens im Interview berichtet, werden die Voraussetzungen für eine Zeit- und Kostenersparnis durch ein optimiertes Ineinandergreifen zwischen Up- und Downstream-Processing geschaffen.

Dr. Christoph Glanemann, Projektmanager und Leiter der Downstream Processing Unit bei Trenzyme © Trenzyme

Seit fast zehn Jahren ist Trenzyme ein Biotech Service-Anbieter in den Bereichen Molekularbiologie, Biochemie und Zelllinienentwicklung. Zum internationalen Kundenkreis des Unternehmens gehören überwiegend Pharma- und Biotech-Unternehmen. Die Abteilung Downstream Processing wird von Dr. Christoph Glanemann geleitet, der an der Universität Köln promoviert hat und Forschungsaufenthalte am Massachusetts Institute of Technology und an der Harvard Medical School verbrachte.

Herr Glanemann, welche Arbeit leistet die Downstream Processing-Einheit bei Trenzyme?

Unsere Arbeit umfasst alle Aufgaben von der Aufarbeitung von Biomasse bis hin zur Analytik des gereinigten Proteins. Bezogen auf das Zielprotein arbeiten wir gewöhnlich im Maßstab vom Mikrogramm- bis zum unteren Grammbereich. Dabei versuchen wir ständig die Produktausbeute und -qualität durch eine optimale Auswahl und Kombination von Chromatographie-Methoden und Chromatographie-Medien, z.B. mit höheren Bindekapazitäten, zu steigern.

Welche Verfahren setzen Sie generell ein?

Wir verfügen über state-of-the-art FPLC- und HPLC-Anlagen und es stehen natürlich alle relevanten Chromatographie-Methoden (z.B. Affinity, Ion Exchange, Reversed Phase, Size Exclusion) zur Verfügung. Hierbei können nach der klassischen Vorgehensweise „Capture, Purify, Polish" und je nach gewünschtem Reinheitsgrad des Proteins mehrere Methoden kombiniert werden. Zur anschließenden Proteinanalytik verwenden wir Methoden, die vom einfachen SDS-PAGE über ELISA bis hin zur komplexen Massenspektrometrie reichen. Darüber hinaus führen wir nach Kundenwunsch oft auch eine funktionelle Analyse des Proteins durch, z.B. durch in vitro Enzymaktivitätsassays oder zellbasierte Assays in der Zellkultur. Die meisten unserer Projekte stammen aus der aktuellen Forschung und Entwicklung unserer Kunden, was bedeutet, dass es oft kaum Vorarbeiten zu dem jeweiligen Protein gibt. Daher umfasst ein typisches Kundenprojekt neben der Expression (upstream process development) auch die komplette Prozessentwicklung zur Reinigung des Proteins.

Welche Strategie verfolgen Sie beim Aufreinigungsverfahren?

Trenzyme wurde im Jahre 2000 als Spin-off des mikrobiologischen Instituts der Universität Konstanz gegründet. © Trenzyme

Generell wird der Proteinreinigungsprozess zuerst im analytischen small-scale Maßstab entwickelt und optimiert, bevor er anschließend auf einen größeren Maßstab übertragen werden kann. Während dieser Entwicklungsphase werden sowohl die optimale Auswahl als auch die beste Abfolge verschiedener Chromatographie-Methoden festgelegt. Ein wichtiges Kriterium für die Auswahl der Reihenfolge verschiedener Chromatographie-Schritte ist z.B., dass sich bestimmte Methoden nutzen lassen, um das Probenvolumen von mehreren Litern auf ein praktikableres kleineres Volumen zu verringern. Ebenso gehört z.B. dazu, je nach Proteineigenschaften (z.B. theoretischer isoelektrischer Punkt oder Molekulargewicht) eine bestimmte Chromatographie-Methode auszuwählen und zu optimieren, beispielsweise Ionenaustauschchromatographie oder Gelfiltration. Im Falle der Ionenaustauchchromatographie wird z.B. getestet, bei welchem ph-Wert sich das Protein am besten von allen anderen Proteinen trennen lässt. Zusätzlich ist während der gesamten Prozessentwicklung eine lückenlose Dokumentation selbstverständlich unerlässlich, um später alle Prozesse mit gleichbleibend hoher Qualität reproduzieren zu können.

Wie handhaben Sie prozessbedingte Kontaminationen?

Je nach Fragestellung können bestimmte Verunreinigungen durch die Prozessführung entweder von Beginn an vermieden werden, oder während des Prozesses abgereichert werden. Beispielsweise kann eine Verunreinigung durch Endotoxine vermieden werden, indem das Protein nicht in Bakterien produziert wird. Für den Fall, dass bestimmte Verunreinigungen jedoch nicht von Beginn an durch die Prozessführung zu vermeiden sind, können sie meist durch die Kombination mehrerer Chromatographieschritte bis zum gewünschten Grenzwert abgereichert werden.

Aufwendungen für die Aufreinigung haben bekanntlich einen hohen Anteil an den Herstellungskosten: Auf welche Art und Weise versuchen Sie diese zu reduzieren?

Das Ineinandergreifen von Upstream und Downstream Processing, die Auswahl spezieller Chromatographie-Medien und ein von Beginn an durchdachter Transfer vom small-scale zum large-scale Prozess ermöglichen uns, wertvolle Zeit zu sparen und Kosten zu minimieren. Typische Kundenprojekte dauern zwischen wenigen Tagen und mehreren Wochen, je nach Umfang des Projektes. Entscheidend ist ebenfalls unsere Unternehmensstruktur. Einen Zeitvorsprung bieten uns hier die kurzen Wege zur Geschäftsleitung und eine dadurch auf ein Minimum beschränkte Bürokratie. Durch unsere Möglichkeit sowohl Upstream als auch Downstream Processing zu entwickeln und zu optimieren, können Leerlaufzeiten und Kommunikationsprobleme zwischen diesen Teilbereichen vermieden werden. Es müssen keine Proben hin- und hergeschickt werden und rund um die Uhr ist eine direkte Kommunikation zwischen den Mitarbeitern der verschiedenen Abteilungen möglich, was die Sache deutlich beschleunigt. Dafür wird bereits im Upstream Processing der Weg geebnet.

Welche Voraussetzungen werden beim Upstream Processing geschaffen, die einen reibungslosen Übergang zum Downstream ermöglichen und damit auch einen Zeitgewinn?

Zunächst einmal kann im Rahmen unserer Proteinexpression zwischen allen relevanten Systemen von E. coli über Hefen bis zu Insekten- und Säugerzellen gewählt werden. Auch hieraus ergibt sich ein weiterer großer Zeit- und damit Kostenvorteil. Anstatt sequentiell ein Expressionssystem nach dem anderen auf optimale Expression zu testen, können wir mehrere Ansätze parallel entwickeln und mit dem besten System direkt zum Downstream Prozess übergehen. Ein Beispiel: Ein Kunde möchte ein Säuger-Protein exprimiert und gereinigt haben. Dies soll nicht nur in großer Menge produziert werden, sondern später auch in einem funktionellen Assay eingesetzt werden. Es ist aber noch unbekannt, ob posttranslationale Modifikationen für die Funktion des Proteins wichtig sind. Diese zwei Anforderungen lassen sich als garantierte Funktionalität des Proteins bei möglichst hoher Ausbeute zusammenfassen. Durch die Möglichkeit, das Protein zur gleichen Zeit sowohl in Bakterien, Hefen, Insekten- und Säugerzellen zu exprimieren, kann die funktionelle Analytik im small-scale Maßstab ebenfalls parallel mit gereinigten Proben aus allen Expressionssystemen geschehen. Zum Beispiel könnte es in diesem Fall gut sein, dass die Expression in Bakterien und Hefen zwar zu einer hohen Ausbeute geführt hat, dieses jedoch den funktionellen Test nicht bestanden hat. Andererseits hat die Expression in Insekten- und Säugerzellen zwar geringere Ausbeuten erbracht, jedoch erfüllt das aus diesen Systemen gewonnene und gereinigte Protein den kritischen funktionellen Test. Durch einen solchen Ansatz konnte auf schnellstmöglichem Weg das optimale Expressionssystem gewählt und der Upstream Process entwickelt werden, während gleichzeitig schon small-scale Downstream Protokolle etabliert wurden.

Seiten-Adresse: https://www.gesundheitsindustrie-bw.de/fachbeitrag/aktuell/upstream-und-downstream-processing-im-einklang