ILM - FLIM/SLIM zur Beobachtung von Protein Interaktionen
Im Rahmen des Verbundprojektes OPTIMA (Optische Methoden zum in vivo Monitoring von Protein-Interaktionen am Beispiel der Alzheimer Demenz), welches gemeinsam mit der Abteilung Neurologie der Universität Ulm durchgeführt und vom BMWi gefördert wird, werden optische Verfahren zum in vivo Monitoring von komplexen intrazellulären Protein Interaktionen entwickelt.
FLIM des Donors ohne FRET (EGFP).
© ILM
Die Untersuchungen basieren auf der sogenannten FLIM/FRET – Methode. Dabei wird die Interaktion zwischen zwei Proteinen über den resonanten Energietransfer (FRET) eines Donormoleküls auf ein Akzeptormolekül, üblicherweise über die Fluoreszenzabklingzeit des Donor-Proteins, beobachtet. Findet FRET statt, so wird die Fluoreszenzabklingzeit des Donors kürzer. Dies ist in der Abbildung für Neuroblastomzellen demonstriert, die mit EGFP (Donor ohne Akzeptor), bzw. EGFP-mRFP (Donor mit Akzeptor), transfiziert sind. Die Fluoreszenzabklingzeit wird in der Zeitdomäne über TCSPC („time-correlated-single–photon-counting“) gemessen. Für spezifische Proteinwechselwirkungen, die im Rahmen der Alzheimer Demenz (AD) eine Rolle spielen, ist diese Methode besonders interessant. Durch das Projekt werden entscheidende Erkenntnisse zur Entstehung der AD und anderer Erkrankungen erwartet, die der Prävention und Therapie dienen und deshalb zum in vivo Screening neuer potentieller Medikamente von Bedeutung sind.
FLIM des Donors mit FRET (EGFP-mRFP).
© ILM
Komplexe Protein-Interaktionen spielen bei intrazellulären Signal- und Transportmechanismen im Rahmen der AD und anderer neurologischer Erkrankungen eine wesentliche Rolle.
Das Verständnis dieser Mechanismen ist notwendig, um die Funktionsstörungen in Zellen, die zur Entstehung dieser Erkrankungen beitragen, aufzuklären. Damit können dann gezielt neue Medikamente getestet und entwickelt werden.
Als verbesserte Kontrastmethode wird insbesondere die spektral aufgelöste FLIM („fluorescence lifetime imaging“) -Technik (SLIM) für in vivo Anwendungen optimiert und die Datenerfassung und Datenauswertung beschleunigt und vereinfacht. Durch diese Technik werden die Abklingzeiten aller spektralen Komponenten, also insbesondere von Donor und Akzeptor gleichzeitig erfasst. Mit Hilfe einer globalen Analyse ist damit eine verbesserte FRET-Analyse zu erwarten, die besonders bei komplexen, mehrere Partner umfassenden Interaktionen von Bedeutung ist. Die Datenanalyse erfordert jedoch einen zuverlässigen Algorithmus, mit dem das Resultat schnell und einfach dargestellt werden kann und der im Rahmen dieses Projektes entwickelt wird.