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ILM - Mikroskopie

Für die Bearbeitung vieler Fragestellungen in der Biologie und Medizin auf zellulärer Ebene werden unterschiedliche lichtmikroskopische Verfahren angewandt. Dies schließt in vielen Fällen die Verwendung von Lasern ein, sei es bei der Manipulation oder bei der lasergestützten mikroskopischen Untersuchung der Zellen. Als besonders erfolgreich, ja nahezu unverzichtbar, haben sich hier die verschiedenen Varianten der konfokalen Laser-Mikroskopie erwiesen.

Fluoreszenzmikroskopie

Das konfokale Prinzip: Nur das Licht aus dem Fokusbereich des Objektivs gelangt durch die Lochblende auf den Detektor. Licht aus den anderen Ebenen wird so wirksam unterdrückt. © ILM
Neben den üblichen Methoden der Mikroskopie im Auflicht und Durchlicht oder Varianten davon, wie die Phasenkontrastmikroskopie, sind vor allem verschiedene fluoreszenzmikroskopische Verfahren in der zellbiologischen Forschung von Bedeutung. Als besonders hilfreich zur Untersuchung in lebenden Zellen haben sich in letzter Zeit fluoreszierende Fusionsproteine (z.B. Green Fluorescent Protein, GFP und seine Abkömmlinge gekoppelt an das zu untersuchende Protein) erwiesen, da sie sich transient oder stabil in Zellen exprimieren lassen.

Die Aufklärung photobiologischer Prozesse in lebenden Zellen ist bei uns ein Anwendungsschwerpunkt dieser modernen Mikroskopiemethoden. Darüber  hinausgehende Fragestellungen – etwa zu anderen zellulären Mechanismen – , wie sie sich aus der Kooperation mit externen Partnern aus der Universität oder der Industrie ergeben, werden ebenfalls bearbeitet. Hierzu gehören Fragen der Zelldifferenzierung im Rahmen der Tumorbiologie oder des tissue engineering.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

Das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop stellt eine wertvolle Bereicherung für die Mikroskopie gerade in der Biologie dar. Von besonderer Bedeutung sind dabei Verfahren, bei denen die laserinduzierte Fluoreszenz ausgenutzt wird.

Verwendet man zur Anregung der Fluoreszenz ultrakurzgepulste Laser, wie zum Beispiel den Ti:Saphir-Laser, so erweitert sich das Methodenspektrum nochmals um die nichtlinearen Anregungsprozesse, wie die Zwei- oder Mehrphotonenanregung.

Zur Untersuchung an lebenden Zellen stehen am ILM zwei konfokale Mikroskope zur Verfügung. Das eine, ein LSM 510 Meta (Zeiss), ist mit spektral auflösenden Detektoren ausgestattet, so dass für jeden Bildpunkt komplette Spektren aufgenommen werden können. Durch eine nachfolgende Analyse (on-line fingerprinting) können einzelne Fluorophore getrennt werden, selbst wenn sich ihre Emissionsspektren teilweise überlappen.

Das zweite konfokale Mikroskop, ein LSM 410 (Zeiss), wird hauptsächlich zur bildgebenden Darstellung der Fluoreszenzabklingzeiten verwendet. Beide Mikroskope lassen optische Schnitte in die Tiefe (z), so dass sich aus dem kompletten z-Stapel die 3D Information über das Objekt gewinnen lässt. Durch einen  Dekonvolutionsalgorithmus können daraus 3DModelle erstellt werden. Hinzu kommt noch eine Palette spezieller Bildverarbeitungssoftware, die eine Vielzahl von Bildanalysen gestattet, so dass unter anderem FRET (Förster-Resonanz-Energie-Transfer) und FRAP (Fluoreszenz-Recovery-After-Photobleaching) Experimente optimal ausgewertet werden können.

Zeitaufgelöste konfokale Laser- Scanning Mikroskopie (FLIM)

Fluoreszenzbilder von Endothelzellen (inkubiert mit Calcein-AM): Totalreflexionsmikroskopie (A) vs. Auflichtmikroskopie (B). © ILM

Die Fluoreszenzmikroskopie bietet

die Möglichkeit, berührungslos Einblicke in zellbiologische Prozesse zu gewinnen. Dazu wird in der Regel die Fluoreszenzintensität spektral aufgelöst oder integral registriert. Ein weiteres Charakteristikum neben dem Fluoresznezspektrum ist die Fluoreszenzabklingzeit. Diese ist weitgehend unempfindlich gegenüber der  Fluorophorkonzentration, dafür jedoch sehr empfindlich auf Änderungen der lokalen Umgebung, insbesondere auf die Nähe anderer Fluorophore. Durch bildgebende Darstellung der  Fluoreszenzabklingzeiten (Fluorescence Lifetime Imaging, FLIM) können daher die Moleküle in unterschiedlicher  biologischer Umgebung, also auch in  unterschiedlichen Zellkompartimenten, selektiv dargestellt werden.

Spektral- und zeitaufgelöste konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (SLIM)

Die Kombination aus spektral- und zeitaufgelöster Detektion ist geeignet, die Spezifität hinsichtlich der verschiedenen Fluorophore zu verbessern und damit das Anwendungsspektrum deutlich zu erweitern. Wir haben Methoden zum spektralen l Lifetime-Imaging (SLIM) am Laser-Scanning-Mikroskop LSM 410 implementiert und an unterschiedlichen zellbiologischen Fragestellungen erprobt. Dazu wurde ein neu entwickeltes Modul, bestehend aus einem Zeilendetektor mit 16 Photomultipliern zum zeitkorrelierten Einzelphotonenzählen mit  vorgeschaltetem Spektrometer, an das Mikroskop adaptiert. Den 16 spektral unterschiedlichen Kanälen können die jeweiligen  FLIM-Bilder zugeordnet werden. Diese weitere Dimension ermöglicht eine noch spezifischere Analyse der Vorgänge in lebenden Zellen.

Totalreflexionsmikroskopie

Bei der Totalreflexionsmikroskopie (TIRFM) erfolgt die Beleuchtung der Probe unter Totalreflexionsbedingungen durch das Licht aus dem evaneszenten elektromagnetischen Feld an der Grenzfläche zweier optischer Medien mit unterschiedlichen Brechungsindizes. Das elektromagnetische Feld nimmt mit dem Abstand zur Grenzfläche  exponentiell ab; seine Eindringtiefe wird durch Wellenlänge und den Einfallswinkel der  Laserstrahlung bestimmt und kann zwischen etwa 50 nm und 300 nm variiert werden.

In der Mikroskopie werden die  unterschiedlichen Medien durch den Zellträger (Glas) und die anliegende  Zytoplasmamembran der Zellen gebildet. Aufgrund der kleineren Eindringtiefe des Lichts können mit Hilfe passender Fluorophore (exogene Marker oder fluoreszierende Fusionsproteine) Membraneigenschaften oder  Transportvorgänge charakterisiert werden. Darüber hinaus lassen sich so auch Veränderungen der Zelltopographie quantifizieren. Messaufbau und Anwendungen wurden in enger Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Schneckenburger (Hochschule Aalen) realisiert.
Ansprechpartner Fluoreszenzmikroskopie und Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie:
Wolfgang Strauß
E-Mail: wolfgang.strauss(at)ilm.uni-ulm.de

Ansprechpartner FLIM, SLIM, TIRFM:
Dr. Angelika Rück
E-Mail: angelika.rueck(at)ilm.uni-ulm.de
Seiten-Adresse: https://www.gesundheitsindustrie-bw.de/fachbeitrag/pm/ilm-mikroskopie-1