ILM - Mikroskopische Analysen
Zu den etablierten Methoden am ILM zählen unter anderem die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, die Multicolor Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und die Laser-Mikrodissektion.
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
M-FISH Falschfarben-Karyogramm eines normalen Hautfibroblasten (46,XX).
© ILM
Die in-situ-Hybridisierung (FISH) erlaubt den Nachweis von DNA-Sequenzen in morphologisch intaktem Gewebe, im Interphase-Zellkern und auf Metaphase-Chromosomen. Dabei nutzt man die Eigenschaft der Nukleinsäuren, Basenpaarungen mit komplementären Strängen eingehen zu können. Bei der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) sind die an einen Einzelstrang bindenden DNA-Sonden mit Fluorophoren markiert. Diese können mit einem Fluoreszenzmikroskop detektiert werden. Anwendungen von FISH sind beispielsweise der Nachweis einzelner Gene in Zellkernen und auf Chromosomen, oder ganzer Chromosomen in Metaphase-Spreitungen. Auf diese Weise lassen sich wichtige Erkenntnisse über das Genom einzelner Zellen gewinnen, und so z.B. überzählige Kopien bestimmter Gene erkennen.
Multicolor Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (M-FISH)
Mit Hilfe der neuen Methode Multicolor-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (M-FISH oder 24-Farben-FISH), einer Weiterentwicklung der FISH-Technik, lässt sich jedes der 24 verschiedenen menschlichen Chromosomen in einer spezifischen Farbe darstellen. Dies gelingt durch die Verwendung von chromosomenspezifischen DNA-Sonden, die mit unterschiedlichen Kombinationen von insgesamt fünf Fluorochromen markiert sind und einem Fluoreszenzmikroskop mit einem daran angepassten Lichtfiltersatz detektiert werden. Durch die unterschiedliche Farbcodierung der Chromosomen lassen sich in einem Präparat, selbst bei komplexen
Karyotypen, strukturelle chromosomale Mutationen (Translokationen, Insertionen oder Deletionen) schneller und sensitiver darstellen als mit herkömmlicher Zytogenetik. Auch Änderungen der Chromosomenzahl werden sicher erkannt.
Neben der Anwendung der M-FISH-Technik in der Tumorzytogenetik findet die Methode vor allem auch in der strahlenbiologischen Forschung immer breitere Verwendung. Auf diese Weise lassen sich durch energiereiche Strahlung, wie Röntgenstrahlung oder UV-Licht, induzierte Erbgutschädigungen nachweisen.
Laser-Mikrodissektion
Auswahl eines mikroskopischen Objekts aus der Nierenrinde (Glomerulus, oben) und zurückbleibendes Gewebe nach Mikrodissektion (unten.)
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Mit Hilfe der Laser-Mikrodissektion gelingt es, aus Gewebeschnitten bzw. Zellkulturen ausgewählte Bereiche zu isolieren, so dass sie für weitere Analysen, wie PCR oder im - Fall von Zellen - zur Weiterkultivierung zur Verfügung stehen. Dies erlaubt interessierende Regionen spezifisch zu untersuchen, ohne dass die Umgebung die Ergebnisse verfälscht.
Die Proben werden zuerst mikroskopisch untersucht und der interessierende Bereich markiert. Dann wird der Strahl eines Stickstofflasers über das Mikroskopobjektiv auf die Probe fokussiert und durch Verfahren der Probe ein Schnitt um die zu isolierende Region gemacht. Anschließend wird dieser Bereich mit einem stärkeren, defokussierten Laserpuls zur weiteren Untersuchung in ein Gefäß katapultiert.
Mit ähnlichen Techniken lassen sich auch Manipulationen an lebenden Zellen durchführen, wie zellchirurgische Eingriffe oder eine gezielte transiente Erhöhung der Permeabilität der Zellmembran bei der so genannten Optoporation.