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Molekülspezifische Diagnose von Stoffwechselerkrankungen

Lysosomale Speichererkrankungen sind eine Gruppe von seltenen, zum Teil angeborenen Stoffwechselerkrankungen, die wegen ihrer unspezifischen Symptome oft gar nicht oder nicht exakt diagnostiziert werden können. Prof. Dr. Michael Przybylski vom Steinbeis-Transferzentrum Biopolymeranalytik und Biomolekül-Massenspektrometrie an der Universität Konstanz hat gemeinsam mit der Centogene AG ein kürzlich auch zum Patent angemeldetes Verfahren zur Messung der Enzymaktivität entwickelt. Der Einsatz einer neuartigen Substanzklasse erlaubt eine parallele Messung sowohl mittels Fluorimetrie als auch mittels Massenspektrometrie. Damit konnten bereits neue Methoden zur Feststellung von bisher nicht diagnostizierbaren Erkrankungen auf den Weg gebracht werden. Im Interview mit der BIOPRO Baden-Württemberg berichtet der Konstanzer Forscher über die Hintergründe.

BIOPRO: Herr Professor Przybylski, welche Motivation steckt hinter Ihrem vor Kurzem zum Patent angemeldeten Verfahren?

Prof. Dr. Dr. Michael Przybylski forscht im Steinbeis-Transferzentrum Biopolymeranalytik und Biomolekül- Massenspektrometrie an der Universität Konstanz. © Bettina Baumann / BioLAGO

Przybylski: Unser Ziel ist es, neue Verfahren zur Diagnose von lysosomalen Speichererkrankungen zu entwickeln, klinisch zu validieren und weltweit in Diagnostik und Therapie einzusetzen. Dafür haben wir eine neue Substanzklasse von Substrat-Derivaten für lysosomale Enzyme entwickelt und mit ihr bereits Methoden zur Diagnostik von etwa 40 der circa 70 bis 80 bekannten lysosomalen Speichererkrankungen. Einige dieser Methoden sind bereits im Anfangsstadium klinischer Studien und werden in verschiedenen klinischen Zentren getestet. Diese Erweiterung des bisher diagnostisch verfügbaren Leistungsspektrums wird in den nächsten Jahren einen wesentlichen Beitrag zur Entwicklung neuer Therapeutika auch für bisher nicht therapierbare Patienten beziehungsweise Erkrankungen liefern.

„Lysosomal storage diseases“ (LSD) manifestieren sich in einer Reihe von Organen. Welche Bedeutung hat das für die Erkennung der Erkrankungen?

Die Diagnose der LSDs gestaltet sich oft sehr schwierig, da die Symptomatik sehr breit und unspezifisch ist. Ärzte können die Diagnose anhand der klinischen Symptome, wie zum Beispiel Organveränderungen, Leber- oder Milzvergrößerungen, oft nur auf eine Gruppe von möglichen Erkrankungen eingrenzen. Soweit Tests vorhanden sind, müssen diese möglichen Erkrankungen einzeln getestet werden, was mit einem erheblichen Aufwand verbunden ist und eine deutliche Verzögerung der Diagnose mit sich bringen kann. Für den Erfolg von Enzymersatztherapien ist aber entscheidend, die Diagnose so früh wie möglich stellen zu können, da die Therapien bereits vorhandene Schädigungen nicht wieder rückgängig machen können. Gibt es keinen Test und damit auch keine Diagnose, kann den Patienten nicht effektiv geholfen werden.

Wie erfolgt die derzeitige Erkennung der LSDs in der klinischen Praxis?

Der derzeitige Standard zur Diagnose einer LSD ist die Bestimmung der katalytischen Aktivität von lysosomalen Enzymen. Dazu wird zu einer Blutprobe ein Substrat-Derivat zugegeben, also ein Molekül, das vom zu untersuchenden Enzym spezifisch umgesetzt wird. Das dabei entstehende Produkt wird mittels Fluorimetrie bestimmt. Die Konzentration des Produkts ist ein Maß für die Aktivität des Enzyms.

Sie setzen aber vor allem auf massenspektrometrische Verfahren?

Ja. In den letzten Jahren wurden erste massenspektrometrische Verfahren für etwa 6 bis 8 Speichererkrankungen entwickelt. In diesen bisherigen Verfahren wurden spezifische Substrate verwendet, die ausschließlich für die Massenspektrometrie anwendbar sind. Die Ergebnisse dieser diagnostischen Bestimmungen sind nur schwer mit den Daten aus konventionellen fluorimetrischen Verfahren vergleichbar. Für klinisch-diagnostische Reihenuntersuchungen zur Etablierung und Validierung der neuen Methoden ist diese Vergleichbarkeit aber ebenso dringend erforderlich wie für zukünftige serielle Anwendungen.

Ihre Forschung im Rahmen des Transferprojekts soll also neue Perspektiven für weltweite molekülspezifische Diagnostik und damit Ansätze für neue Therapie-Entwicklungen liefern. Welche Erfolge können Sie mit den zum Patent angemeldeten Methoden bereits verzeichnen?

Einzelne Bluttropfen auf transportstabilen Filterkarten genügen den Forschern bereits zur Diagnose. © Bettina Baumann / BioLAGO

Uns ist die Entwicklung eines neuen Prinzips der Diagnostik mit Hilfe einer neuen Substanzklasse gelungen. Mit den von uns entwickelten Substrat-Analoga ist die gleichzeitige Bestimmung der Enzymaktivität mittels Fluorimetrie-Messung und Tandem-Massenspektrometrie mit ein- und demselben Substrat möglich. Das Besondere an den neuen Substrat-Analoga ist, dass sie eine funktionelle Gruppe enthalten, die nach der erfolgten Umsetzung durch das Enzym fluorimetrisch bestimmt werden kann. Als Standard sowohl für die Massenspektrometrie als auch für die Fluorimetrie wird eine Isotopen-markierte Variante des enzymatischen Produkts verwendet. Die Isotopen-markierte Variante ist chemisch identisch mit dem Produkt, hat aber eine geringfügig unterschiedliche Masse. Dadurch kann sie im Massenspektrometer eindeutig vom Produkt unterschieden werden. Der große Vorteil der Verwendung identischer Substrate mit beiden Messmethoden liegt darin, dass die klinischen Ergebnisse unmittelbar vergleichbar sind und dadurch eine hohe Zuverlässigkeit der Daten erhalten wird.

Wie sind die von Ihnen entwickelten Substrate aufgebaut?

Bei den Substrat-Analoga handelt es sich um neuartige Umbelliferyl-Derivate, die an das eigentliche Substrat, einen Kohlenwasserstoff wie zum Beispiel Glucose, gekoppelt sind. Umbelliferon ist ein Derivat des sekundären Pflanzenstoffs Cumarin mit einer zusätzlichen Hydroxyl-Gruppe, das bei UV-Licht-Einstrahlung eine blaue Fluoreszenz zeigt, wodurch die Umbelliferyl-Derivate fluorimetrisch bestimmt werden können. Diese Substrat-Analoga ermöglichen darüber hinaus die Entwicklung von massenspektrometrischen Multiplex-Bestimmungen von mehreren Enzymen mit einer Probe durch unterschiedliche Substitution der Umbelliferyl-Derivate.

Wie funktionieren diese Multiplex-Bestimmungen?

Mit Hilfe der Multiplex-Diagnostikverfahren können gleichzeitig die Aktivitäten mehrerer Enzyme gemessen und so in einem Schritt mehrere Erkrankungen getestet werden. Das war mit der bisher verfügbaren Methode der Fluorimetrie nicht möglich, sondern ist nur mittels Massenspektrometrie durchführbar. „Multiplex“ bedeutet hier, dass mehrere Enzymreaktionen in nur einem Test parallel ablaufen und anschließend erfasst werden. Dazu werden mehrere, mit jeweils einem anderen Kohlenwasserstoff verknüpfte Substrat-Analoga in einem Ansatz kombiniert, von denen jedes spezifisch nur von einem der zu messenden Enzyme umgewandelt wird. Die bei der Umsetzung entstehenden unterschiedlichen Produkte ermöglichen dann die Messung der jeweiligen Aktivität des Enzyms.

Können damit beliebig viele Enzyme parallel analysiert werden?

Die Kombinationsmöglichkeiten sind dadurch begrenzt, dass nicht alle Substrate in biochemisch vergleichbarem Maß umgesetzt werden. Darum fassen wir jeweils mehrere Enzyme mit vergleichbarem Substratumsatz in einer Gruppe zusammen. Diese parallele Messung mehrerer Enzymaktivitäten ist für die klinische Praxis äußerst vorteilhaft. Sie könnte in Zukunft auch für generelle Neugeborenen-Screenings eingesetzt werden. Wir können Kits zusammenstellen, die in einer Messung die Funktion von zum Beispiel 5 bis 8 Enzymen gleichzeitig testen. In unserem zum Patent angemeldeten Verfahren sind bereits Multiplex-Bestimmungen für 20 bis 25 Speichererkrankungen enthalten.

Wie sehen die weiteren Pläne für das Transferprojekt aus?

Zum einen planen wir die Entwicklung von weiteren Substrat-Analoga für etwa 20 Speichererkrankungen sowie die Validierung und Etablierung der Diagnostik in der klinischen Praxis durch Tests mit Patientenproben und Vergleiche mit bisher verfügbaren Techniken. In einem zweiten Teil des Projekts beschäftigen wir uns mit der Entwicklung einer auf der Affinitäts-Massenspektrometrie basierenden Methode für eine direkte molekülspezifische Proteinbestimmung der Enzyme. Mit dieser Methode wird die Konzentration des Enzyms direkt gemessen, nicht dessen Aktivität über die Konzentration des Produkts.

Das hat den großen Vorteil, dass zwischen völlig fehlendem und vorhandenem, aber Funktions-defektem Enzym unterschieden werden kann, was mit der Aktivitätsmessung allein nicht möglich ist. Durch Kombination dieser neuen Methode mit der bisher etablierten Technik zur Enzymaktivitätsbestimmung lässt sich feststellen, ob ein Enzym fehlt oder defekt ist. Bei der Entwicklung der neuen Affinitäts-Massenspektrometrie sind wir derzeit noch im Anfangsstadium. Die Anwendung der hier entwickelten Verfahren ist jedoch keineswegs auf lysosomale Speichererkrankungen bzw. deren Enzyme beschränkt, sie kann auch auf viele andere Protein-/Peptid-Biomarker ausgeweitet werden.

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