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Screenen mit Qualität und Quantität

Die Abteilung Early Discovery des forschenden pharmazeutischen Unternehmens Nycomed GmbH begleitet den frühen Forschungsverlauf von der Target-Identifizierung bis hin zur Generierung von Leitstrukturen. Eine wesentliche Komponente ist dabei die Hochdurchsatz-Substanztestung mithilfe von drei Roboterstrassen, die unterschiedliche Anforderungsprofile erfüllen. Michael Statnik fragte Dr. Stefanie Polej für www.bio-pro.de, wie der Prozess der automatisierten Analyse von Molekülaktivitäten beim Konstanzer Unternehmen verläuft.

Frau Dr. Polej, seit wann gibt es das High-Throughput-Screening bei Nycomed?

Testungen im Hochdurchsatz-Verfahren werden bei Nycomed (vormals ALTANA Pharma beziehungsweise Byk-Gulden) seit 1998 durchgeführt.

Mit welchen Systemen und Maschinen erfolgt die automatisierte Suche nach Leitstrukturen in ihrem Labor?

Für die Hochdurchsatztestung verfügen wir über insgesamt drei verschiedene Roboterstraßen, die je nach Anforderung und entsprechend ihrer Stärken eingesetzt werden und über unterschiedliche Messgeräte verfügen.
Eine der Anlagen dient Standard-Testungen, d.h. Prüfverfahren mit hoher Geschwindigkeit und entsprechend hohem Durchsatz mit über 100.000 Datenpunkten pro Tag. Die zweite Anlage (bis zu 60.000 Datenpunkte pro Tag) wird für enzymatische Assays eingesetzt und erlaubt Testungen radioaktiver Assays im Hochdurchsatz. Darüberhinaus verfügen wir über eine sehr flexible Anlage für beispielsweise konfokale mikroskopische Verfahren im High-Throughput-Verfahren.
Drei verschiedene Roboterstraßen werden bei Nycomed für die Hochdurchsatztestung eingesetzt (Foto: Nycomed GmbH)
Die Anzahl der tatsächlichen Testpunkte pro Tag hängt dabei unter anderem von der Durchsatzrate des Meßgerätes ab: Die Aufnahme von mikroskopischen Bildern und die dafür benötigte Zeit wird durch die Belichtungsparameter bestimmt, also fast so wie bei einer Digitalkamera – nur dass hier eben mehrere Hundertausend Bilder für eine Screening-Kampagne aufgenommen und prozessiert werden müssen. Dieses Verfahren kostet natürlich, neben entsprechenden Rechnerkapazitäten, Zeit. Machbar sind aber auch mit unserem Imaging-System in der Roboterstraße über 65.000 Datenpunkte pro Tag.

Wie läuft ein Screening-Prozess in den Roboterstraßen ab?

Unsere modernste Screening-Anlage ist mit einem zentralen Förderband für die Testplatten bestückt. An den einzelnen Arbeitsstationen holen Greifarme die Assayplatten ab und liefern diese in den Transportprozess zwischen den einzelnen Geräten zurück. Zeitgleich können verschiedene Stationen angesteuert werden, solange auf dem Förderband freie Plätze vorhanden sind, was für eine maximale Effizienz in der Auslastung der Geräte sorgt. Damit wird diese Anlage außergewöhnlich schnell. Die hochflexible Roboterstraße dagegen ist mit einem auf einer Schiene montierten, beweglichen Greifarm ausgestattet. Da dieser Greifarm die jeweiligen rechts und links der Straße positionierten Stationen für die Pipettierung, Inkubationen und Messungen ansteuern muss, schränkt diese Konzeption den Durchsatz etwas ein.
Ein 384er Pipettierkopf sorgt für den Substanztransfer auf 384er oder 1536er Mikrotiterplatten (Foto: Nycomed GmbH)

Und wie viele Testdurchläufe erlauben ihre Anlagen?

Allgemein gilt natürlich: je komplexer ein Assay, desto wahrscheinlicher ist, dass die Anzahl möglicher Datenpunkte sinkt. Wird beispielsweise eine robotergestützte Haupttestung mit primären Zellen durchgeführt, kann hier die zuliefernde Zellkultur zum limitierenden Faktor werden. Ähnliches gilt für die im Test benötigte Inkubationszeit oder auch die Anzahl der Zugaben, z.B. weiterer Substanz und Reagenzien oder zusätzliche Puffer. Bei Standard-Testungen ist dies in aller Regel nicht der Fall, so dass hier weit mehr Roboterläufe durchgeführt werden. Fällt die Entscheidung zugunsten eines pharmakologisch hoch relevanten aber komplexeren und zeitaufwendigen Modells aus, wird auf hohes Tempo verzichtet. In diesem Fall wird jedoch eine höhere Qualität für die Aussagekraft der Daten erzielt, weil weitere wichtige Parameter abgegriffen werden können. Generell betrachtet haben sich die Durchsätze in den letzten Jahren durch die Miniaturisierung auf Volumina zwischen fünf und acht Mikroliter pro Testpunkt signifikant erhöht.
Nycomeds kompakte, modulare Screening-Anlage, auf der ebenfalls die Platten auf einer Art Schienensystem hin und her fahren (Foto: Nycomed GmbH)

Welche Substanzen werden mithilfe der Roboter auf ihre Wechselwirkung getestet?

Üblicherweise werden in Testungen die funktionellen Eigenschaften der Targets überprüft, das heißt reine Bindungsassays sind hier unüblich und kommen nur zu Substanzprofilierungszwecken in Frage. In der Haupttestung finden alle gängigen Testformate wie Enzymtests, zelluläre Testungen, darunter Reportergen-basierte sowie Ionenkanal-Testungen, Eingang in das Screening. Entscheidend ist, dass die zu testenden Targets in ein messbares Detektionsformat überführt werden können. Dafür stehen die üblichen Verfahren, das heißt Mikrotiterplatten-Reader für Absorption, verschiedene fluoreszenten Verfahren, Lumineszenz, konfokale Mikroskopie bis zu 1536-Well-Format aber auch radioaktive Testungen zur Verfügung. Generell arbeiten wir beim HTS je nach Anforderung mit 384- oder 1536-Well Mikrotiterplatten.

Welche Rolle spielen sekundäre Testungen? Können hierbei zusätzliche Fragestellungen geklärt, z. B. wie gut die Substanz löslich ist oder ob sie an etwas anderes in der Zelle bindet?

Im Rahmen der Nachtestung, die ebenfalls mithilfe der Roboter vollständig automatisiert erfolgt, werden die Substanzen dosisabhängig in ihrer Wirkung überprüft. Man sammelt dabei unter anderem Erkenntnisse darüber, ob die Treffer aus der Primärtestung unerwünschte Nebenwirkungen auf verwandten Targets zeigen, die sie für eine weitere Bearbeitung ungeeignet machen. In der Routine werden zusätzlich erste Parameter der ADME-Kategorie wie Aufnahme, Verteilung, Verstoffwechselung sowie Ausscheidung von Substanzen erfasst. Löslichkeits- und Permeabilitätstests fließen ebenso in die Hit-Evaluierung ein wie Daten aus toxikologischen Assays. Ebenfalls wird die metabolische Stabilität und die Interaktion mit Zytochromen überprüft, um eine möglichst hohe Qualität der Leitstrukturen zu gewährleisten und den Medizinalchemikern erste Priorisierungen anhand eines weit komplexeren Substanzprofils zu erlauben als dies noch vor wenigen Jahren machbar war. Sämtliche Assays erfolgen streng standardisiert und größtenteils automatisiert. Durch entsprechende Qualitätskontrollen wird der Ablauf dieser Testungen entsprechend verfolgt und die Ergebnisse werden erst nach positiver Bewertung des Prozesses freigegeben.

Gibt es auch Situationen, in denen man auf manuelle Experimente anstatt automatisierter Verfahren zurückgreift?

Dies ist bei komplexeren Testsystemen der Fall, die nicht in ein Mikrotiterplatten-basierendes, robotertaugliches Format überführt werden können und mit deutlich kleineren Mengengerüsten in Bezug auf die zu testenden Substanzen durchzuführen sind. Die Entscheidung, ob eine Testung automatisiert oder manuell durchgeführt werden soll, hängt somit grundsätzlich von mehreren verschiedenen Faktoren ab.
Zur Person: Dr. Stefanie Polej studierte Biochemie an der Universität und der Medizinischen Hochschule in Hannover und promovierte anschließend am Max-Planck-Institut für Biophysik in Frankfurt am Main. Sie arbeitete als Laborleiterin im Institut für Molekulare Screening Technologie in der Pharmaforschung der Bayer AG. Im Jahre 2004 nahm sie ihre Arbeit bei ALTANA Pharma auf und ist nach der Übernahme durch Nycomed im Bereich Early Discovery tätig.
Seiten-Adresse: https://www.gesundheitsindustrie-bw.de/de/fachbeitrag/aktuell/screenen-mit-qualitaet-und-quantitaet/