„Aus einer unzähligen Menge an Schlüsseln den einen finden, der in das auserwählte Schloss passt“. So oder so ähnlich lässt sich die Suche nach einem spezifischen, pharmazeutisch relevanten Protein zur Behandlung einer Krankheit salopp umschreiben. Als „Screening“ wird im Allgemeinen der erste Schritt im Entdeckungsprozess einer neuen Arznei bezeichnet, bei dem Millionen von Substanzen daraufhin getestet werden, ob sie sich an das krankheitsauslösende Protein (Target) binden können, um dessen Wirkung zu hemmen und im Körper somit die heilende oder lindernde Reaktion herbeizuführen. Insbesondere geht es darum, Hinweise darauf zu sammeln, welche Merkmale die Moleküle, die sich am Target anlagern können, haben müssen und ob sie bestimmte Atome unbedingt oder keinesfalls enthalten sollten. Untersucht wird bei einem Screening-Verfahren zum Beispiel die optische Absorption, die Floureszenzintensität oder die Polarisation in einem Testvolumen.
Bis Anfang der 90er Jahre wurde die Suche nach Ausgangssubstanzen, in erster Linie noch „von Hand“ durchgeführt und nahm teilweise mehrere Monate oder gar Jahre in Anspruch. Diese Zeiten gehören inzwischen der Vergangenheit an, denn mittlerweile haben riesige Roboteranlagen in den Pharmaunternehmen Einzug gehalten, die die Wechselwirkung zwischen dem Zielmolekül und den synthetisierten Substanzen vollautomatisch durchtesten. Mithilfe der Kerntechnologie High-Throughput-Screening (HTS) werden Hunderttausende bis Millionen Substanzen in kürzester Zeit analysiert.

Hochdurchsatz-Systeme führen die Durchmusterung der biologischen Proben generell in Mikrotiterplatten mit 384 oder 1536 Probelöchern komplett automatisch durch. Der Prozess schließt Sortier-, Portionier-, Misch- und Messarbeiten ein. Während des Verfahrens fügen Flüssigkeits-Handlingsstationen unterschiedliche Reagenzien zu genau festgelegten Zeitpunkten in exakt definierten Mengen den einzelnen Probelöchern zu, während danach ein optisches Lesegerät den Verlauf der molekularen Wechselwirkung misst und feststellt. Dabei wird der gesamte Prozess vom Handling der Mikrotiterplatten bis zur Datenerfassung durch immer leistungsfähigere Computer-Software unterstützt. Derzeitige HTS-Systeme arbeiten mit einem Durchsatz von mindestens 10.000 Proben am Tag, die so genannten Ultra-HTS-Systeme können gar 100.000 bis 200.000 Substanzen täglich messen. In den meisten Fällen bringt jede zweihundertste bis tausendste Substanz den erhofften Effekt, der als Hit (Treffer) bezeichnet wird.

Für das HTS haben Pharma- und Biotech-Firmen umfangreiche Sammlungen mit allen erdenklichen Substanzen angelegt. Diese stammen entweder aus traditionellen Substanzbibliotheken, aus Bibliotheken der kombinatorischen Chemie, oder sind Naturstoffe und -derivate. Zu den am häufigsten verwendeten Assay-Typen gehören Rezeptor-Bindungsstudien und Enzymaktivitätsmessungen sowie Second-Messenger- und Reporter-Gen-Untersuchungen. Bei den Targets sind es Kinasen sowie verschiedene andere Enzyme (z.B. Phosphatasen, Proteasen, Nucleasen), Zelloberflächen-Rezeptoren oder Ionenkanäle.

Das Hochdurchsatz-Verfahren ist im Forschungsprozess zu einer Schlüsseltechnologie geworden. So beruhen mehr als 60 Prozent der aktuell vollentwickelten Leitstrukturoptimierungsprogramme bei Boehringer Ingelheim auf dem Erfolg von HTS, und allein in den USA werden jährlich über 2,5 Milliarden US-Dollar für HTS-Produkte und HTS-Dienstleistungen ausgegeben. Große Pharmabetriebe investieren jährlich bis zu 30 Millionen Euro in Screening-Technologien, die meisten Ausgaben werden für die Assayentwicklung getätigt. Den Kunden kostet ein Screening-Verfahren laut Dr. Werner Stürmer, Leiter der Abteilung ‘Early Discovery‘ bei Nycomed, „häufig 0,50 bis 2 Euro pro Testpunkt“.

Beim High-Throughput-Screening kommen traditionell biochemische Assays
zum Einsatz, die z.B. die Substanz-Target-Bindungen oder Enzymhemmungen analysieren. Jedoch liefert das Verfahren neben vielen so genannten falsch-positiven Hits keine Aussage über Interaktionen der Substanz mit anderen Elementen von biologischen Systemen. Hier fungiert das High-Content-Screening (HCS) mit zellbasierten Assays als eine Weiterentwicklung.

Während bei HTS-Verfahren in der Regel somit nur ein Parameter getestet wird, besteht der besondere Wert des HCS in der parallelen quantitativen Erfassung mehrerer Parameter auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Dazu gehören beispielsweise Absorption, Permeabilität, Selektivität oder metabolische Merkmale. Das ebenfalls automatisierte HCS-Verfahren kann als Floureszenz-Mikroskopie an markierten Zellen beschrieben werden. Hierbei werden zunächst Zellen auf Mikrotiterplatten ausgesät, nach einer darauffolgenden Behandlung mit einer Substanz fixiert und anschließend über spezifische Antikörperfärbungen oder die Färbung mit spezifischen Farbstoffen fluoreszenzmarkiert. Von den gefärbten Zellen werden dann automatisch Bilder aufgenommen, die anschließend über Softwarealgorithmen quantitativ ausgewertet werden.

HCS-Systeme arbeiten mit Bildanalyse-Technologien und hochwertiger Bioinformatik-Software, die zur Verarbeitung der riesigen und komplexen Datenmengen erforderlich ist. Bis zu 60.000 Substanzen lassen sich mit der HCS-Technologie täglich testen.

Die Bedeutung von Computertechnik und Bioinformatik nimmt bei der Ermittlung von Leitstrukturen generell immer weiter zu. Denn obwohl die Vorhersagegenauigkeit bei computerunterstützten Screenings noch nicht an das Niveau des physikalischen Rasterfahndung herankommt, bringen rechnerbasierte Methoden insbesondere eine Zeit- und Kostenersparnis und dienen dazu, die Zahl der Screeningsubstanzen am Projekt orientiert effizient zu erhöhen. Im Allgemeinen liegen die Kosten für Screens je nach Größe und Aufwand zwischen 35.000 und 700.000 Euro bis zu den validierten Hits. Laut Dr. Herbert Köppen, der die Abteilung „Computational Chemistry“ bei Boehringer Ingelheim in Biberach leitet, sind die Ausgaben für die klassische physikalische Testung „bis zu zehn Mal“ so hoch wie bei einem „virtuellen“ Screeningvorgang.

Eines der wesentlichen Werkzeuge des „virtuellen“ Screenings, bei dem aus einer großen Zahl von Substanzen durch rechnerische Selektion von Verbindungen oder Bibliotheken biologisch wirksame Verbindungen identifiziert werden, ist die Molekulare Modellierung. Hierbei werden das Target sowie die zu prüfenden Substanzen am Computer nachgebildet, mit dem Ziel der Simulation ihrer Wirkungsstruktur. Da die Moleküle eines pharmazeutischen Wirkstoffs und eines körpereigenen Proteins, auf welches dieser einwirken soll, räumlich kongruent sein müssen, wird getestet, welche Moleküle so gebaut sind, dass sie sich an das Target binden können.

Methodisch betrachtet kommen unter anderem Grafik-Algorithmen (zur Visualisierung von Molekülen), geometrische Berechnungen (Moleküloberfläche) oder Verfahren wie das Docking zum Einsatz. Beim Docking werden Ligandstrukturen in eine Bindungstasche eines Proteins mithilfe von 3D-Strukturinformationen und der Berechnung von Bindungsenergien nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip angelegt („gedockt“) und eingepasst. Die Basis der computergestützten Wirkstoffsuche bilden hauptsächlich große Datenbanken und Substanzbibliotheken. In großen Pharmafirmen können mit speziellen Suchtechniken problemlos eine Billion virtueller Strukturen täglich am Rechner gescreent werden. Die weltgrößte physische Substratkollektion enthält laut Dr. Andrea Zaliani von der Molecular-Modelling-Abteilung Nycomeds „insgesamt rund 50 Millionen“ Strukturen.

In vielen Unternehmen fungiert die Molekulare Modellierung als unterstützendes Mittel von HTS-Abteilungen. Häufig geschieht die Wirkstoffsuche parallel durch das HTS und das virtuelle Screening, wobei letzteres aktiv mithilft, Verbindungsklassen zu identifizieren und target-orientierte kommerzielle Verbindungen vorzuschlagen, die dann beschafft und getestet werden. Nicht notwendigerweise stammen somit am Ende die identifizierten Leitstrukturen aus einem einzigen Screening-Ansatz, sondern können ihren Ursprung in virtuellen oder strukturgetriebenen Ansätzen aus der Medizinalchemie haben.

Durch die fortschreitende Robotisierung der Wirkstoffforschung ist bei Screening-Prozessen und Technologien vermehrt eine fachübergreifende Zusammenarbeit gefragt. Gemeinsam mit Ingenieuren und Physikern erarbeiten heutzutage die biologischen Labore großer Pharmaunternehmen automatisierte Testprotokolle und werden bei computerbasierten Ansätzen oder bei der Datenerfassung und -prozessierung von IT-Spezialisten unterstützt.

Um den Durchsatz beim Hochdurchsatz zu beschleunigen, arbeiten Unternehmen unermüdlich daran, Assays weiter zu miniaturisieren, z.B. in Form einer höheren Welldichte bei Mikrotiterplatten oder durch den Einsatz von Biochips, auf denen Proteine, Peptide oder Nukleinsäuren immobilisert werden. Insbesondere durch die stetige Erweiterung der Substanzdatenbanken steigt der Druck, höhere Durchsatzraten zu erreichen. Während die Substanzbibliotheken von HTS-Abteilungen Ende der 90er Jahre noch durchschnittlich 50.000 bis 350.000 Verbindungen enthielten, sind es heute zwischen 1 und 1,5 Millionen. „In der Regel wachsen Bibliotheken jährlich um bis zu 10 Prozent an, mit striktem Fokus auf sinnvoller Strukturdiversität“, so Dr. Werner Stürmer.

Auf der anderen Seite sind Pharmaunternehmen derzeit darin bestrebt, mithilfe von neuen, maßgeschneiderten Screening-Strategien qualitativ hochwertigere Ergebnisse zu liefern, die beispielsweise die Anzahl „falsch-positiver“ Hits reduzieren. Einen der Trends der automatisierten Wirkstoffsuche bilden Technologien wie das Auto-Patch-Clamping, ein Verfahren zur Aktivitätsmessung von Ionenkanälen, die als Zellmembran-Bestandteile neben Enzymen und Rezeptoren zu der dritten großen Gruppe von Targets für pharmakologische Wirkstoffe gehören. Fast ein Zehntel aller Projekte in der Pharma-Industrie basieren aktuell bereits auf Ionenkanälen. Denn mithilfe von Patch-Clamp-Robotern ist es möglich, ein schnelles Screening von spannungsabhängigen und ligandenaktivierten Ionenkanälen durchzuführen und an einer einzigen Zelle unterschiedliche Substanzen zu testen. Ein entsprechender Patch-Clamp-Automat für Hochdurchsatzmessungen wird in der Wirkstoffforschung derzeit stark nachgefragt.

Prognosen zufolge werden sich Hochdurchsatzverfahren in Zukunft außerdem verstärkt auf die Integration zusätzlicher Targetklassen wie Protein-RNA-/Protein-DNA–Interaktionen oder transmembrane Rezeptoren durch neue Methoden fokussieren.