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Downstream Processing: Aufreinigung mit Optimierungspotential

Biopharmazeutische Hersteller holen immer mehr therapeutische Proteine aus ihren Fermentern. Der Produktivitätszuwachs hat der Industrie aber ein Problem beschert. Denn die Reinigung der biotechnologischen Produkte (im Jargon Downstream Processing) ist kostspielig und verschlingt bis zu 80 Prozent der Herstellungskosten. Vielerorts gibt es Bestrebungen, nach dem Herstellungsprozess (Upstream) den Downstream-Prozess zu optimieren.

Bei monoklonalen Antikörpern, dem am größten wachsenden Marktsegment, haben die Hersteller dank molekularbiologischen Fortschritts und deshalb optimierter Zellkulturtechnik die Ausbeute vom Milligramm-Maßstab in den Gramm-Maßstab gesteigert.

Biochemische Reinigung im biopharmazeutischen Herstellungsprozess. Im Bild: Chromatographiesäulen, im Hintergrund sind Puffervorlagebehälter zu sehen. © Boehringer Ingelheim

Kosten laufen in der Aufreinigung auf

Fachleute haben Folgendes ausgerechnet. Nimmt die Produktausbeute um das Zehnfache zu (von 0,1 auf 1,0 g/l), verschieben sich die Anteile des Verhältnisses Herstellungs- und Aufreinigungskosten von 55:45 auf 30:70. Das Problem: Herstellungskosten verhalten sich umgekehrt proportional zu den Ausbeuten, für die Kosten des Downstream gilt dies aber nicht.

Um die steigende Nachfrage des Markts zu befriedigen, wächst die Protein-Fracht für die kostspielige Chromatographie. Das erhöht die Zahl ihrer Zyklen oder macht größere Chromatographiesäulen (bis zu zwei Meter Durchmesser) erforderlich. Das wiederum führt dazu, dass immer größere Mengen filtriert werden müssen, was die Filtrationszeit verlängert oder mehr Fläche notwendig macht.

Physikalische und ökonomische Grenzen

"Zellernte" mit Hilfe der Mikrofiltration im biopharmazeutischen Downstream Processing. © Boehringer Ingelheim

Die frühe Isolierung einschließlich der „Ernte“, die Abtrennung des Zellmaterials und die Klärung sind nach Aussage von Experten kein Problem. Schwieriger verhält es sich mit der Isolierung, wo die Chromatographie mit ihren immanenten Begrenzungen eingesetzt wird. Sehr große chromatographische Säulen sind zwar technisch machbar, stoßen aber an physikalische und ökonomische Grenzen. Verständlich, dass die biopharmazeutische Industrie nach kostengünstigen Alternativen zur Chromatographie sucht, nicht zuletzt unter dem wachsenden Kostendruck im Gesundheitswesen. So gibt es Bestrebungen, das teure und für die Affinitätschromatographie notwendige Protein A (es kann Säuger-Proteine binden) zu ersetzen oder darauf zu verzichten und die Zahl der Säulen-Chromatographie-Schritte von drei auf zwei oder schließlich auf einen zu beschränken. Auch Membran-Adsorber sind als Alternative im Gespräch.

Neue Verfahren für deutschen Produktionsstandort

Für Deutschland, weltweit zweitgrößter Produktionsstandort für Biopharmazeutika, sind neue Aufreinigungsverfahren aus Wettbewerbsgründen wichtig. Das Bundesforschungsministerium hat mit einer Förderinitiative reagiert (https://www.gesundheitsindustrie-bw.dewww.bmbf.de/foerderungen/11545.php) und will das Problem durch die Zusammenarbeit von Wirtschaft und Wissenschaft grundsätzlich angehen und die brachliegende deutsche Forschung und Lehre wiederbeleben.

Besser versteht das Aufreinigungsproblem, wer die historische Entwicklung der roten Biotechnologie sieht. In ihrer Inkubationsphase (1982-1994) beschränkten sich Biotech-Start-ups auf die schnellstmögliche Entwicklung und Zulassung rekombinanter Proteine zur Substitutionstherapie. Vielfach wurden Laborprozesse direkt in den Produktionsmaßstab übernommen. Die therapeutischen Dosen rekombinanter Proteine lagen meist im μg-Bereich. In den Bioreaktoren produzierten E.-coli-Bakterien und tierische Zellkulturen (vor allem Hamster-Eizellen) die meist noch nicht glykosilierten therapeutischen Proteine. Der Prozess erbrachte Ausbeuten von 10 bis 100 mg pro Liter. Das Augenmerk lag auf der Produktion, die Aufreinigung wurde vernachlässigt.

Auf Produktinnovation folgt Prozessinnovation

Downstream GMP-Produktionssuite © Rentschler Biotechnlogie

In der zweiten Phase, der Erfolgsphase, änderte sich das FuE-Portfolio nachhaltig. Maßgeschneiderte Fusionsproteine, humanisierte Antikörper und FABs (antigenbindender Teil eines Antikörpers) wurden für Onkologie und Immunkrankheiten eingesetzt, erforderten Dosen im mg-Bereich. Ebenso gründlich änderten sich die Herstellungsprozesse: Auf die Produkt- folgte die Prozessinnovation. Weil Glykoproteine immer wichtiger wurden, verlagerte sich das Produktionsportfolio von prokaryontischen Systemen zu eukaryontischen.

Das wachsende Verständnis molekularbiologischer und zellulärer Prozesse verbesserte die Expressionsraten vorhandener Zelllinien und ließ neue Expressionssysteme wie NSO (Mausmyelom-Zellen) entstehen. In standardisierten Fermentationsverfahren stieg die Ausbeute aus tierischen Zellkultursystemen auf bis zu 2 g pro Liter, im Entwicklungsprozess auf das Doppelte. Die Produktivität wuchs um das 50- bis 100-fache.

Weniger stürmisch verlief die Innovation beim Downstream. Im gleichen Zeitraum stieg die Bindekapazität von Chromatographiematerialien, die bei der anschließenden Aufreinigung der Proteine eingesetzt werden, gerade einmal um den Faktor 3. „Die gängige Antwort auf die Upstream-Innovation war der lineare Upscale des Downstream-Bereichs“ (Allgaier).

Millionenschwere Nachrüstung

Weil die Produktionsanlagen der ersten Generation auf den Upstream-Prozess ausgerichtet waren, fehlten bei höheren Fermentationsausbeuten Reserven für die Aufreinigung. Vielfach mussten die Anlagen nachgerüstet werden, die Kosten lagen im zweistelligen Millionenbereich.
Ende der 90er Jahre hatten sich zwei großtechnische Anlagentypen herausgebildet. Ihnen gemeinsam ist die Nutzung als Multi-Produktanlagen in Fed-Batch-Technologie mit einer Reaktorkapazität von 6 x 15.000 Liter mit dreiwöchigen Turn-Over-Perioden und einer jährlichen Gesamtanlagenkapazität von 500 bis 600 kg rekombinantem Protein.

Nahm die Produktivität dank optimierter Zellkulturtechnik und Fermentationsbedingungen massiv zu, blieb der technische Prozess der Fermentation im Prinzip unverändert. Up- und Downstream liefen kontinuierlich immer weiter auseinander. Mitte der 80er Jahre lagen die Produktausbeuten bei 50 bis 100 mg/l, 25 Jahre später hatten sie sich verhundertfacht.

Produkt- und prozessimmanente Gefahren

Therapeutisch genutzte Proteine aus dem Bioreaktor müssen in mehreren Schritten gereinigt werden. Die Verunreinigungen werden vom Prozess oder vom Produkt verursacht und sind eine potenzielle Gefahr für den Patienten, weshalb diese unerwünschten Substanzen auf ein unbedenkliches Maß abgereichert werden müssen. Die Verunreinigungen gefährden auch das Produkt (Denaturierung).

Prozessbedingte Verunreinigungen können Reste der Wirtszellen (Proteine, Nukleinsäuren) sein oder der Zellkultur (Medienbestandteile) entstammen oder aus der Aufarbeitung (Salze oder abgelöste Chromatographie-Liganden) herrühren. Verunreinigungen können auch produktabhängig sein. Das können unerwünschte molekulare Varianten wie verkürzte Formen, Vorläufer, hydrolytische Abbauprodukte oder modifizierte Formen sein, die beispielsweise falsch glykosiliert wurden. Zu den produktspezifischen unerwünschten Varianten zählen auch Polymere und Aggregate.

Entfernt werden müssen auch alle weiteren Stoffe mikrobiologischen, biochemischen oder chemischen Ursprungs, die nicht direkt zum Herstellungsprozess gehören. Solche Kontaminanten sind beispielsweise Viren, die in Zellkulturen auftreten können.

Großtechnische Aufreinigung unter ökonomischem Diktat

Die biopharmazeutische Aufreinigung lässt sich sicherlich verbessern – läuft sie im großtechnischen Maßstab ab, ist sie aber wirtschaftlichen Zwängen unterworfen. Produktion und Reinigung dürfen die Rentabilität des Biopharmazeutikums nicht gefährden. Auch die Zeit, innerhalb der ein neuer Aufreinigungsprozess etabliert wird, spielt eine maßgebliche Rolle. Überdies muss die Entwicklung des Verfahrens mit der vorklinischen und klinischen Entwicklung des Medikamentes abgestimmt sein.
Hinzu kommt, dass es „den“ Aufreinigungsprozess nicht gibt. Jeder Wirkstoff hat seinen „eigenen“ Downstream, der auf sein spezielles biochemisches und biophysikalisches Profil und auf seine spezifischen Fermentationsbedingungen abgestimmt sein muss.

Allgemein lässt sich die Aufreinigung in vier Schritte zerlegen: Zuerst wird das Zielprotein isoliert, aufkonzentriert und stabilisiert („Capturing"), dann werden die Viren entfernt. In einem dritten Schritt reichert man die meisten Verunreinigungen wie Nukleinsäuren, andere Proteine und Endotoxine ab, ehe noch verbliebene Spuren von Verunreinigungen und Kontaminanten beseitigt („Polishing") werden. Neben Filtration und Fällung spielen (säulen-)chromatographische Verfahren eine zentrale Rolle, von denen es sehr viele mit unterschiedlichen Materialien gibt.

Prozessentwicklung nach Versuch-und-Irrtum-Prinzip

Die Aufreinigung des Zielproteins oder -moleküls macht sich dessen Form, Größe, Löslichkeit, Oberflächenladung oder biospezifische Affinität zu Bindungspartnern zunutze. Das vervielfacht die Anzahl möglicher Prozessalternativen. Unter dem Diktat des Kosten- und Zeitdrucks wie der anlagenspezifischen Beschränkungen ist es den Herstellern unmöglich, die jeweils optimalen Aufreinigungsschritte zu entwickeln. In der Regel werden diese Prozesse nach dem Trial-and-Error-Prinzip entwickelt und etabliert, sobald der Prozess „funktioniert“.

Viele Schritte im Aufreinigungsprozess sind aus Sicherheitsgründen (wie die Entfernung von Viren oder DNA) unverzichtbar, Einzel- oder Teilschritte indes sind nach Aussage von Industrievertretern optimierbar oder lassen sich möglicherweise zusammenlegen. Kostentreiber sind vor allem die säulenchromatographischen Schritte. Deren Membranen für die Reinigung sind sehr teuer und machen neben Fixkosten einen großen Teil aus.

Wer nach den Gründen für die jahrelange Vernachlässigung des Downstream Processing sucht, sollte auch dies ins Kalkül ziehen: Während die Etablierung von Masterzellbanken und die Optimierung der Zellkulturtechnik ohne fremde Hilfe geschah, saßen bei Fragen der Aufreinigung stets Dritte am Tisch – Innovation konnte unter solchen Umständen nur eingeschränkt stattfinden.

Aus Herstellersicht ließe sich die Aufreinigung sinnvoll verbessern, wenn für die Fermentation weniger komplexe Medienzusätze (sogenannte Minimalmedien) zur Verfügung stünden. Hohe Priorität genießen auch Bestrebungen, die Zahl der Aufreinigungsschritte zu verringern. Das würde viel Zeit und Kosten sparen, obendrein den Verlust an Wirkstoff begrenzen, den jeder weitere Aufreinigungsschritt bedeutet. Neuartige Gele und doppelte Bindungskapazität könnten die Effektivität chromatographischer Verfahren steigern.

Paradigmenwechsel in der Branche

Dass die biopharmazeutische Industrie ein Aufreinigungsproblem hat, wird in der Fachliteratur gelegentlich bestritten. Betroffen seien lediglich 10 bis 20 Jahre alte Produktionslagen, die mit der stark gestiegenen Produktausbeute nicht mithalten konnten. Andere vertreten die Ansicht, das Problem werde überbewertet, betreffe nur wenige Produkte, die in sehr großem Maßstab hergestellt werden.
Gegen die „Downstream-Bottleneck“-These wenden manche ein, dass heutige Biopharmazeutika immer potenter würden, was niedrigere Dosierungen und auch kleinere Produktionschargen zur Folge hätte.

Wer die Diskussion in der Fachliteratur verfolgt und Experten hört, beobachtet in der Branche einen Paradigmenwechsel. Wie in anderen ausgereiften Technologien auch wird an „Denkverboten“ gerüttelt: Lässt sich die Wirkstoff-Ernte nicht teilen oder in zwei Teilschritten reinigen? Muss alles Produzierte auch aufgereinigt werden? Soll für eine 10 bis 20 Prozent höhere Ausbeute das Downstream Processing für eine zweistellige Millionensumme umgebaut werden?

Der Trend zu neuen Wirkstoffklassen macht auch vor Anlagenkonzepten und Technik nicht Halt. „In Zukunft“, prognostiziert Dr. Hermann Allgaier von Merckle Biotec, werden Fermentation und Aufreinigung „vermehrt in Disposables ablaufen“. Diese Einmal-Produktionssysteme verringern den Reinigungsaufwand und vor allem deren Validierung beträchtlich. Die Zukunft, so Allgaier, gehört kleinen, schnellen Fregatten, die den schweren, unbeweglichen Ozeandampfer ablösen. Der Produktivitätsfortschritt macht es möglich: Für die Produktion von 2,5 Tonnen Wirkstoff braucht es heute 2k-Fermenter, wo früher 12-k-Fermenter nötig waren.

Literatur und Quellen (Auszug):
1. Farid, Suzanne: Economic Drivers and Trade-Offs in Antibody Purification Processes, in: Int. BioPharm, 2, March, 2009
2. Gottschalk, Uwe: The Renaissance of Protein Purification, BioPharm International, June 2, 2006.
3. Jagschies, G./O’Hara, A.: Debunking Downstream Bottleneck Myth, in: GEN, Aug. 7/2007, S.  62ff.
4. Morrow, K.J: Gen.: Removing Impediments in Downstream Processing, in: GEN, Aug. 2007, S. 44ff.
5. Dechema (Hrsg.): Neue Anlagenkonzepte und Trend zu Disposables in Biopharma-Prozessen. Trendreport Nr. 15, Februar 2009
6. DeFife, K./Pierce, L.: Versatiliy of a Single-Use Bioreactor Platform for Culture of Diverse Cell Types, in: BioPharm International, Feb. 1, 2009
7. Arzneimittelreport 2009 der Gmünder Ersatzkasse
8. Langer, E./Ranck, J: Capacity Bottleneck Squeezed By Downstream Processes, in: BioProcessInternational, March 2006, p. 14ff.
9. Allgaier, H: Rote Biotechnologie im 21. Jahrhundert, in: Pharm. Ind. 68, Nr. 2, S. 157-169 (2006).

Glossar

  • Antikörper sind körpereigene Proteine (Immunglobuline), die im Verlauf einer Immunantwort von den B-Lymphozyten gebildet werden. Sie erkennen in den Körper eingedrungene Fremdstoffe (z. B. Bakterien) und helfen im Rahmen einer umfassenden Immunantwort, diese zu bekämpfen.
  • Bakterien sind mikroskopisch kleine, einzellige Lebewesen, die zu den Prokaryoten gehören.
  • Biotechnologie ist die Lehre aller Verfahren, die lebende Zellen oder Enzyme zur Stoffumwandlung und Stoffproduktion nutzen.
  • Desoxyribonukleinsäure (DNS / DNA) trägt die genetische Information. In den Chromosomen liegt sie als hochkondensiertes, fadenförmiges Molekül vor.
  • Escherichia coli (Abk.: E. coli) ist ein Colibakterium, das im menschlichen Darm vorkommt. Varianten dieses Colibakteriums (E. coli K12), denen bestimmte, für das Überleben in freier Wildbahn notwendige Eigenschaften des Wildtypbakteriums fehlen, werden in der Gentechnik häufig als so genannter Empfängerorganismus für die Klonierung von rekombinanten DNA-Stücken eingesetzt.
  • Eukaryonten sind Organismen, deren Zellen einen Zellkern und Organellen besitzen. Zu den Eukaryonten gehören Protozoen (Einzeller), Algen, Pilze, Pflanzen und Tiere (einschließlich Mensch).
  • Ein Fermenter ist ein Gärtank, in dem Bakterien oder Zellkulturen vermehrt werden.
  • Ein Gen ist ein Teil der Erbinformation, der für die Ausprägung eines Merkmals verantwortlich ist. Es handelt sich hierbei um einen Abschnitt auf der DNA, der die genetische Information zur Synthese eines Proteins oder einer funktionellen RNA (z. B. tRNA) enthält.
  • Glykoproteine sind Proteine, welche noch Polysaccharidketten (Mehrfachzucker) gebunden haben (N-Acetylhexosamine, Galaktose, Mannose, Glucose).
  • Liganden sind häufig relativ kleine Moleküle, die genau in die Bindungstasche von Rezeptoren passen. So wie nur ein ganz bestimmter Schlüssel in ein Schloss passt, können nur genau definierte Liganden mit ihren jeweiligen Rezeptoren in Wechselwirkung treten.
  • Lytisch zu sein ist die Eigenschaft eines Bakteriophagen, seine Wirtszelle bei der Infektion zu zerstören.
  • Monoklonale Antikörper sind strukturell identische Antikörper, die daher auch über die exakt gleiche Bindungsstelle für ein Antigen verfügen.
  • Nukleinsäure ist der Oberbegriff für DNA und/oder RNA.
  • Prokaryonten sind einzellige Organismen, die weder Zellkern noch Organelle besitzen (z. B. Bakterien, Blaualgen).
  • Proteine (oder auch Eiweiße) sind hochmolekulare Verbindung aus Aminosäuren. Sie übernehmen vielfältige Funktionen in der Zelle und stellen mehr als 50 % der organischen Masse.
  • Die Rekombination ist der Vorgang, bei dem DNA neu kombiniert wird. Als natürlicher Prozess findet Rekombination bei der geschlechtlichen Vermehrung während der Meiose statt. Bei der In-vitro-Rekombination werden mit Hilfe molekulargenetischer Methoden DNA-Abschnitte unterschiedlicher Herkunft miteinander verknüpft.
  • Ein Virus ist ein infektiöses Partikel (keine Zelle!), das aus einer Proteinhülle und aus einem Genom (DNA oder RNA) besteht. Um sich vermehren zu können, ist es vollständig auf die Stoffwechsel der lebenden Zellen des Wirtsorganismus angewiesen (z.B. Bakterien bei Phagen, Leberzellen beim Hepatitis-A-Virus).
  • Biopharmaka sind Arzneimittel, die mit Hilfe von biologischen Systemen hergestellt werden.
  • Ein Bioreaktor ist ein geschlossenes System, in dem mikrobielle Umsetzungen organischer Substanzen unter kontrollierten Bedingungen stattfinden und gemessen werden können.
  • Endotoxine sind Giftstoffe, die in der Zellwand gram-negativer Bakterien gebunden sind und erst nach deren Absterben frei werden.
  • Fermentiation ist die Bezeichnung für die Umsetzung von biologischen Materialien mit Hilfe von Mikroorganismen oder durch Zusatz von Enzymen (Fermenten). Im eigentlichen Sinn handelt es bei der Fermentation um die anaerobe Oxidation von Zuckern zum Zwecke der Energiegewinnung des metabolisierenden Organismus.
  • Eine Zellkultur ist ein Pool von gleichartigen Zellen, die aus mehrzelligen Organismen isoliert wurden und in künstlichem Nährmedium für Forschungsexperimente im Labor (in vitro) gehalten werden.
  • Eine Zelllinie ist eine dauerhaft etablierte Zellkultur, die sich unter definierten Bedingungen unbegrenzt vermehrt.
  • Onkologie ist die Wissenschaft, die sich mit Krebs befasst. Im engeren Sinne ist Onkologie der Zweig der Medizin, der sich der Prävention, Diagnostik, Therapie und Nachsorge von malignen Erkrankungen widmet.
  • Biochemie ist die Lehre von den chemischen Vorgängen in Lebewesen und liegt damit im Grenzbereich zwischen Chemie, Biologie und Physiologie.
  • Validierung oder Validation ist der Prozess der Prüfung einer These oder eines Lösungsansatzes in Bezug auf das zu lösende Problem.
  • Die Molekularbiologie beschäftigt sich mit der Struktur, Biosynthese und Funktion von DNA und RNA und und deren Interaktion miteinander und mit Proteinen. Mit Hilfe von molekularbiologischen Daten ist es zum Beispiel möglich, die Ursache von Krankheiten besser zu verstehen und die Wirkungsweise von Medikamenten zu optimieren.
  • Die Expression ist die Biosynthese eines Genprodukts (= Umsetzung der genetischen Information in Proteine). Sie erfolgt in der Regel als Transkription von DNA zu mRNA und anschließender Translation von mRNA zu Protein.
  • Toxizität ist ein anderes Wort für Giftigkeit.
  • Ein Polymer ist eine aus gleichartigen Einheiten aufgebaute kettenartige oder verzweigte chemische Verbindung. Die meisten Kunststoffe sind Polymere auf Kohlenstoffbasis.
  • Aggregation ist die funktionelle Zusammenlagerung von Zellen oder Molekülen.
  • Drastische Änderung eines bisher vorhandenen Denkmusters. Durch die Änderung wird eine völlig neue Grundlage für die Wissenschaft und die Forschung geschaffen. In der Biologie wird zum Beispiel die Evolution als Paradigmenwechsel zur Schöpfung angesehen.
  • Substrataufarbeitung
  • wenn etwas nicht genutzt wird, ist es brachliegend
  • Ein Inkubator im biologischen bzw. medizinischen Sinne wird auch als Brutschrank oder Brutkasten bezeichnet. In einem Inkubator können gezielt optimale Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen für Brut- und Wachstumsvorgänge geschaffen werden. Im wirtschaftlichen Bereich bezeichnet der Begriff Einrichtungen und Institutionen, die junge Unternehmen bei der Existenzgründung unterstützen.
  • In der roten Biotechnologie werden biotechnologische Methoden für die Entwicklung und Produktion medizinischer Anwendungen wie Therapeutika, Diagnostika, Impfstoffe etc. genutzt.
Seiten-Adresse: https://www.gesundheitsindustrie-bw.de/de/fachbeitrag/dossier/downstream-processing-aufreinigung-mit-optimierungspotential/