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Wirkstoffscreening - Höher, schneller, weiter durch Automatisierung

In den vergangenen Jahren hat die Automatisierung die Suche nach pharmazeutischen Wirkstoffen revolutioniert. Mithilfe verschiedener Techniken wie dem Hochdurchsatzverfahren oder dem High-Content-Screening ist man heute in der Lage, Tausende von Molekülaktivitäten innerhalb kürzester Zeit vollautomatisch zu analysieren. Mittlerweile erfolgt das „Screening“ nach den richtigen Verbindungen verstärkt computergestützt und virtuell. Dabei ist ein Ende des Trends, den Probendurchsatz immer weiter zu erhöhen, nicht in Sicht.

Screening als Suche nach einer Substanz (blau/rot), die sich an das körpereigene Protein (grau) bindet (Foto: Boehringer Ingelheim)
„Aus einer unzähligen Menge an Schlüsseln den einen finden, der in das auserwählte Schloss passt“. So oder so ähnlich lässt sich die Suche nach einem spezifischen, pharmazeutisch relevanten Protein zur Behandlung einer Krankheit salopp umschreiben. Als „Screening“ wird im Allgemeinen der erste Schritt im Entdeckungsprozess einer neuen Arznei bezeichnet, bei dem Millionen von Substanzen daraufhin getestet werden, ob sie sich an das krankheitsauslösende Protein (Target) binden können, um dessen Wirkung zu hemmen und im Körper somit die heilende oder lindernde Reaktion herbeizuführen. Insbesondere geht es darum, Hinweise darauf zu sammeln, welche Merkmale die Moleküle, die sich am Target anlagern können, haben müssen und ob sie bestimmte Atome unbedingt oder keinesfalls enthalten sollten. Untersucht wird bei einem Screening-Verfahren zum Beispiel die optische Absorption, die Floureszenzintensität oder die Polarisation in einem Testvolumen.
Bis Anfang der 90er Jahre wurde die Suche nach Ausgangssubstanzen, in erster Linie noch „von Hand“ durchgeführt und nahm teilweise mehrere Monate oder gar Jahre in Anspruch. Diese Zeiten gehören inzwischen der Vergangenheit an, denn mittlerweile haben riesige Roboteranlagen in den Pharmaunternehmen Einzug gehalten, die die Wechselwirkung zwischen dem Zielmolekül und den synthetisierten Substanzen vollautomatisch durchtesten. Mithilfe der Kerntechnologie High-Throughput-Screening (HTS) werden Hunderttausende bis Millionen Substanzen in kürzester Zeit analysiert.

High-Throughput-Screening – Im Eiltempo zu den „Hits“

Hochdurchsatz-Systeme führen die Durchmusterung der biologischen Proben generell in Mikrotiterplatten mit 384 oder 1536 Probelöchern komplett automatisch durch. Der Prozess schließt Sortier-, Portionier-, Misch- und Messarbeiten ein. Während des Verfahrens fügen Flüssigkeits-Handlingsstationen unterschiedliche Reagenzien zu genau festgelegten Zeitpunkten in exakt definierten Mengen den einzelnen Probelöchern zu, während danach ein optisches Lesegerät den Verlauf der molekularen Wechselwirkung misst und feststellt. Dabei wird der gesamte Prozess vom Handling der Mikrotiterplatten bis zur Datenerfassung durch immer leistungsfähigere Computer-Software unterstützt. Derzeitige HTS-Systeme arbeiten mit einem Durchsatz von mindestens 10.000 Proben am Tag, die so genannten Ultra-HTS-Systeme können gar 100.000 bis 200.000 Substanzen täglich messen. In den meisten Fällen bringt jede zweihundertste bis tausendste Substanz den erhofften Effekt, der als Hit (Treffer) bezeichnet wird.
Moderne Roboteranlagen führen Substanztests in höchstem Tempo durch. (Foto: Nycomed)
Für das HTS haben Pharma- und Biotech-Firmen umfangreiche Sammlungen mit allen erdenklichen Substanzen angelegt. Diese stammen entweder aus traditionellen Substanzbibliotheken, aus Bibliotheken der kombinatorischen Chemie, oder sind Naturstoffe und -derivate. Zu den am häufigsten verwendeten Assay-Typen gehören Rezeptor-Bindungsstudien und Enzymaktivitätsmessungen sowie Second-Messenger- und Reporter-Gen-Untersuchungen. Bei den Targets sind es Kinasen sowie verschiedene andere Enzyme (z.B. Phosphatasen, Proteasen, Nucleasen), Zelloberflächen-Rezeptoren oder Ionenkanäle.

Das Hochdurchsatz-Verfahren ist im Forschungsprozess zu einer Schlüsseltechnologie geworden. So beruhen mehr als 60 Prozent der aktuell vollentwickelten Leitstrukturoptimierungsprogramme bei Boehringer Ingelheim auf dem Erfolg von HTS, und allein in den USA werden jährlich über 2,5 Milliarden US-Dollar für HTS-Produkte und HTS-Dienstleistungen ausgegeben. Große Pharmabetriebe investieren jährlich bis zu 30 Millionen Euro in Screening-Technologien, die meisten Ausgaben werden für die Assayentwicklung getätigt. Den Kunden kostet ein Screening-Verfahren laut Dr. Werner Stürmer, Leiter der Abteilung ‘Early Discovery‘ bei Nycomed, „häufig 0,50 bis 2 Euro pro Testpunkt“.

Zusätzliche Informationen mit der High-Content-Technik

Beim High-Throughput-Screening kommen traditionell biochemische Assays
zum Einsatz, die z.B. die Substanz-Target-Bindungen oder Enzymhemmungen analysieren. Jedoch liefert das Verfahren neben vielen so genannten falsch-positiven Hits keine Aussage über Interaktionen der Substanz mit anderen Elementen von biologischen Systemen. Hier fungiert das High-Content-Screening (HCS) mit zellbasierten Assays als eine Weiterentwicklung.

Während bei HTS-Verfahren in der Regel somit nur ein Parameter getestet wird, besteht der besondere Wert des HCS in der parallelen quantitativen Erfassung mehrerer Parameter auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Dazu gehören beispielsweise Absorption, Permeabilität, Selektivität oder metabolische Merkmale. Das ebenfalls automatisierte HCS-Verfahren kann als Floureszenz-Mikroskopie an markierten Zellen beschrieben werden. Hierbei werden zunächst Zellen auf Mikrotiterplatten ausgesät, nach einer darauffolgenden Behandlung mit einer Substanz fixiert und anschließend über spezifische Antikörperfärbungen oder die Färbung mit spezifischen Farbstoffen fluoreszenzmarkiert. Von den gefärbten Zellen werden dann automatisch Bilder aufgenommen, die anschließend über Softwarealgorithmen quantitativ ausgewertet werden.

HCS-Systeme arbeiten mit Bildanalyse-Technologien und hochwertiger Bioinformatik-Software, die zur Verarbeitung der riesigen und komplexen Datenmengen erforderlich ist. Bis zu 60.000 Substanzen lassen sich mit der HCS-Technologie täglich testen.

Virtuelle Suche nach geometrische Ähnlichkeiten

Die Bedeutung von Computertechnik und Bioinformatik nimmt bei der Ermittlung von Leitstrukturen generell immer weiter zu. Denn obwohl die Vorhersagegenauigkeit bei computerunterstützten Screenings noch nicht an das Niveau des physikalischen Rasterfahndung herankommt, bringen rechnerbasierte Methoden insbesondere eine Zeit- und Kostenersparnis und dienen dazu, die Zahl der Screeningsubstanzen am Projekt orientiert effizient zu erhöhen. Im Allgemeinen liegen die Kosten für Screens je nach Größe und Aufwand zwischen 35.000 und 700.000 Euro bis zu den validierten Hits. Laut Dr. Herbert Köppen, der die Abteilung „Computational Chemistry“ bei Boehringer Ingelheim in Biberach leitet, sind die Ausgaben für die klassische physikalische Testung „bis zu zehn Mal“ so hoch wie bei einem „virtuellen“ Screeningvorgang.

Eines der wesentlichen Werkzeuge des „virtuellen“ Screenings, bei dem aus einer großen Zahl von Substanzen durch rechnerische Selektion von Verbindungen oder Bibliotheken biologisch wirksame Verbindungen identifiziert werden, ist die Molekulare Modellierung. Hierbei werden das Target sowie die zu prüfenden Substanzen am Computer nachgebildet, mit dem Ziel der Simulation ihrer Wirkungsstruktur. Da die Moleküle eines pharmazeutischen Wirkstoffs und eines körpereigenen Proteins, auf welches dieser einwirken soll, räumlich kongruent sein müssen, wird getestet, welche Moleküle so gebaut sind, dass sie sich an das Target binden können.
Molekulare Modellierung als Werkzeug des Wirkstoffscreenings (Foto: Nycomed)
Methodisch betrachtet kommen unter anderem Grafik-Algorithmen (zur Visualisierung von Molekülen), geometrische Berechnungen (Moleküloberfläche) oder Verfahren wie das Docking zum Einsatz. Beim Docking werden Ligandstrukturen in eine Bindungstasche eines Proteins mithilfe von 3D-Strukturinformationen und der Berechnung von Bindungsenergien nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip angelegt („gedockt“) und eingepasst. Die Basis der computergestützten Wirkstoffsuche bilden hauptsächlich große Datenbanken und Substanzbibliotheken. In großen Pharmafirmen können mit speziellen Suchtechniken problemlos eine Billion virtueller Strukturen täglich am Rechner gescreent werden. Die weltgrößte physische Substratkollektion enthält laut Dr. Andrea Zaliani von der Molecular-Modelling-Abteilung Nycomeds „insgesamt rund 50 Millionen“ Strukturen.

Automatisierung bedarf multidisziplinärer Kooperation

In vielen Unternehmen fungiert die Molekulare Modellierung als unterstützendes Mittel von HTS-Abteilungen. Häufig geschieht die Wirkstoffsuche parallel durch das HTS und das virtuelle Screening, wobei letzteres aktiv mithilft, Verbindungsklassen zu identifizieren und target-orientierte kommerzielle Verbindungen vorzuschlagen, die dann beschafft und getestet werden. Nicht notwendigerweise stammen somit am Ende die identifizierten Leitstrukturen aus einem einzigen Screening-Ansatz, sondern können ihren Ursprung in virtuellen oder strukturgetriebenen Ansätzen aus der Medizinalchemie haben.

Durch die fortschreitende Robotisierung der Wirkstoffforschung ist bei Screening-Prozessen und Technologien vermehrt eine fachübergreifende Zusammenarbeit gefragt. Gemeinsam mit Ingenieuren und Physikern erarbeiten heutzutage die biologischen Labore großer Pharmaunternehmen automatisierte Testprotokolle und werden bei computerbasierten Ansätzen oder bei der Datenerfassung und -prozessierung von IT-Spezialisten unterstützt.

Einbindung innovativer Screening-Werkzeuge

Um den Durchsatz beim Hochdurchsatz zu beschleunigen, arbeiten Unternehmen unermüdlich daran, Assays weiter zu miniaturisieren, z.B. in Form einer höheren Welldichte bei Mikrotiterplatten oder durch den Einsatz von Biochips, auf denen Proteine, Peptide oder Nukleinsäuren immobilisert werden. Insbesondere durch die stetige Erweiterung der Substanzdatenbanken steigt der Druck, höhere Durchsatzraten zu erreichen. Während die Substanzbibliotheken von HTS-Abteilungen Ende der 90er Jahre noch durchschnittlich 50.000 bis 350.000 Verbindungen enthielten, sind es heute zwischen 1 und 1,5 Millionen. „In der Regel wachsen Bibliotheken jährlich um bis zu 10 Prozent an, mit striktem Fokus auf sinnvoller Strukturdiversität“, so Dr. Werner Stürmer.

Auf der anderen Seite sind Pharmaunternehmen derzeit darin bestrebt, mithilfe von neuen, maßgeschneiderten Screening-Strategien qualitativ hochwertigere Ergebnisse zu liefern, die beispielsweise die Anzahl „falsch-positiver“ Hits reduzieren. Einen der Trends der automatisierten Wirkstoffsuche bilden Technologien wie das Auto-Patch-Clamping, ein Verfahren zur Aktivitätsmessung von Ionenkanälen, die als Zellmembran-Bestandteile neben Enzymen und Rezeptoren zu der dritten großen Gruppe von Targets für pharmakologische Wirkstoffe gehören. Fast ein Zehntel aller Projekte in der Pharma-Industrie basieren aktuell bereits auf Ionenkanälen. Denn mithilfe von Patch-Clamp-Robotern ist es möglich, ein schnelles Screening von spannungsabhängigen und ligandenaktivierten Ionenkanälen durchzuführen und an einer einzigen Zelle unterschiedliche Substanzen zu testen. Ein entsprechender Patch-Clamp-Automat für Hochdurchsatzmessungen wird in der Wirkstoffforschung derzeit stark nachgefragt.

Prognosen zufolge werden sich Hochdurchsatzverfahren in Zukunft außerdem verstärkt auf die Integration zusätzlicher Targetklassen wie Protein-RNA-/Protein-DNA–Interaktionen oder transmembrane Rezeptoren durch neue Methoden fokussieren.

Glossar

  • Antikörper sind körpereigene Proteine (Immunglobuline), die im Verlauf einer Immunantwort von den B-Lymphozyten gebildet werden. Sie erkennen in den Körper eingedrungene Fremdstoffe (z. B. Bakterien) und helfen im Rahmen einer umfassenden Immunantwort, diese zu bekämpfen.
  • Desoxyribonukleinsäure (DNS / DNA) trägt die genetische Information. In den Chromosomen liegt sie als hochkondensiertes, fadenförmiges Molekül vor.
  • Enzyme sind Katalysatoren in der lebenden Zelle. Sie ermöglichen den Ablauf der chemischen Reaktionen des Stoffwechsels bei Körpertemperatur.
  • Ein Gen ist ein Teil der Erbinformation, der für die Ausprägung eines Merkmals verantwortlich ist. Es handelt sich hierbei um einen Abschnitt auf der DNA, der die genetische Information zur Synthese eines Proteins oder einer funktionellen RNA (z. B. tRNA) enthält.
  • Liganden sind häufig relativ kleine Moleküle, die genau in die Bindungstasche von Rezeptoren passen. So wie nur ein ganz bestimmter Schlüssel in ein Schloss passt, können nur genau definierte Liganden mit ihren jeweiligen Rezeptoren in Wechselwirkung treten.
  • Eine Nuklease ist ein Enzym, das DNA oder RNA spaltet, indem Phosphordiesterbrücken hydrolysiert werden.
  • Nukleinsäure ist der Oberbegriff für DNA und/oder RNA.
  • Proteine (oder auch Eiweiße) sind hochmolekulare Verbindung aus Aminosäuren. Sie übernehmen vielfältige Funktionen in der Zelle und stellen mehr als 50 % der organischen Masse.
  • Rezeptoren sind Moleküle, die u. a. auf Zelloberflächen anzutreffen sind und die in der Lage sind, ein genau definiertes Molekül – ihren Liganden – zu binden. Das Zusammentreffen von Ligand und Rezeptor kann eine Abfolge von Reaktionen innerhalb der Zelle auslösen.
  • Die Ribonukleinsäure (Abk. RNS oder RNA) ist eine in der Regel einzelsträngige Nukleinsäure, die der DNA sehr ähnlich ist. Sie besteht ebenfalls aus einem Zuckerphosphat-Rückgrat sowie einer Abfolge von vier Basen. Allerdings handelt es sich beim Zuckermolekül um Ribose und anstelle von Thymin enthält die RNA die Base Uracil. Die RNA hat vielfältige Formen und Funktionen; sie dient z. B. als Informationsvorlage bei der Proteinbiosynthese und bildet das Genom von RNA-Viren.
  • Screening kommt aus dem Englischen und bedeutet Durchsiebung, Rasterung. Man versteht darunter ein systematisches Testverfahren, das eingesetzt wird, um innerhalb einer großen Anzahl von Proben oder Personen bestimmte Eigenschaften zu identifizieren. In der Molekularbiologie lässt sich so z.B. ein gewünschter Klon aus einer genomischen Bank herausfiltern.
  • Unter Selektion im biologischen Sinn versteht man die Auslese von Organismen aufgrund ihrer Merkmale. Dies kann einerseits durch natürliche Selektionsmechanismen ("survival of the fittest") im Zuge der Evolution geschehen. Unter künstlicher Selektion versteht man andererseits die Auslese von Organismen durch den Menschen, z.B. in der Zucht. Auch in der Gentechnik wird künstliche Selektion angewandt, um einen gentechnisch veränderten Organismus anhand neu eingebrachter Eigenschaften (z. B. Antibiotikaresistenz) zu identifizieren.
  • Eine Sonde im molecularbiologischen Sinn ist ein Stück markierte RNA oder DNA, die mit einer gesuchten Sequenz binden (hybridisieren) kann.
  • Bioinformatik ist eine Wissenschaft, die sich mit der Verwaltung und Analyse biologischer Daten mit Hilfe modernster Computertechnik, befasst. Dient derzeit hauptsächlich zur Vorhersage der Bedeutung von DNA-Sequenzen, der Proteinstruktur, des molekularen Wirkmechanismus und der Eigenschaften von Wirkstoffen. (2. Satz: mwg-biotech)
  • HTS steht für Hochdurchsatzverfahren; mit diesem automatisierten Verfahren kann in kurzer Zeit eine sehr hohe Anzahl von Wirkstoffen auf ihre biologische Wirksamkeit geprüft werden.
  • Ein Peptid ist eine organisch-chemische Verbindung, die aus mehreren Aminosäuren (AS) besteht, die miteinander zu einer Kette verbunden wurden. Die Aminosäuren sind über Peptidbindungen miteinander verknüpft. Als Peptide bezeichnet man relativ kurze Aminosäurenketten (20 - 100 Aminosäuren), dagegen bezeichnet man längere Aminosäurenketten (>100) als Proteine.
  • Kinasen sind Enzyme, die eine Phosphatgruppe von ATP (Adenosintriphosphat) auf andere Enzyme oder chemische Verbindungen übertragen und diese somit phosphorylieren.
  • Biochemie ist die Lehre von den chemischen Vorgängen in Lebewesen und liegt damit im Grenzbereich zwischen Chemie, Biologie und Physiologie.
  • Validierung oder Validation ist der Prozess der Prüfung einer These oder eines Lösungsansatzes in Bezug auf das zu lösende Problem.
  • Die Antikörperfärbung oder auch Immunhistologie ist eine biologische bzw. medizinische Methode, mit der man Proteine mit Hilfe von Antikörpern sichtbar machen kann. Dadurch kann man beispielsweise die Position eines Proteins in einem Gewebe bzw. Zellkompartiment bestimmen.
  • Molekular bedeutet: auf Ebene der Moleküle.
  • Die Pharmakologie ist eine Wissenschaft, die sich mit der Wechselwirkung zwischen Arzneimitteln und Organismen befasst. Dabei gibt es zwei Verfahren zur Beurteilung: Die Pharmakokinetik beschreibt die Aufnahme, Verteilung, Verstoffwechselung und Ausscheidung des Wirkstoffs, die Pharmakodynamik beschreibt die Wirkung des Arzneimittels im Organismus.
  • Ein Assay ist ein standardisierter Reaktionsablauf zum Nachweis einer Substanz mit einer spezifischen Methode (Bsp.: ELISA).
  • Absorption steht in der Biologie für Aufnahme (im pharmakologischen Zusammenhang ist die Aufnahme eines Wirkstoffes gemeint; im physikalischen Zusammenhang ist die Aufnahme von Licht gemeint)
  • Der Metabolismus oder auch Stoffwechsel umfasst Aufnahme, Transport, biochemische Umwandlung und Ausscheidung von Stoffen in einem Organismus. Diese Vorgänge dienen sowohl dem Aufbau der Körpersubstanz als auch der Energiegewinnung. Die beiden gegensätzlichen Vorgänge des Metabolismus werden Anabolismus (aufbauende Vorgänge) und Katabolismus (abbauende Vorgänge) genannt. Viele Enzyme können sowohl katabol als auch anabol wirken, jedoch arbeiten solche Enzyme innerhalb eines biochemischen Weges in der Zelle (z.B. Glykolyse und Gluconeogenese) nicht in beiden Richtungen zugleich.
  • Mit Hilfe der Hochdurchsatz-Technologie ist es möglich, in sehr kurzer Zeit viele Testdaten unterschiedlichster Art zu erzeugen. Dies wird meist erst durch Hilfe moderner Robotersysteme möglich.
  • Eine Mikrotiterplatte ist eine rechteckige Platte aus Kunststoff mit einer bestimmten Anzahl von definierten Vertiefungen (Kavitäten). Sie gehört zu alltäglichen Laborbedarf und findet Anwendung bei verschiedenen gebräuchlichen Methoden wie z.B. dem ELISA.
  • Als Target (engl.:Ziel) werden Biomoleküle bezeichnet, an die Wirkstoffe binden können. Targets können Rezeptoren, Enzyme oder Ionenkanäle sein. Die Interaktion zwischen Wirkstoff und Target löst eine Wirkstoff-Target-spezifische Reaktion aus. Die Identifikation eines Targets ist für die biomedizinische und pharmazeutische Forschung von großer Bedeutung. Erkenntnisse über spezifische Wechselwirkungen helfen grundlegende molekularbiologische Vorgänge zu verstehen und neue Angriffpunkte für Arzneimittel zu identifizieren.
  • Eine Mikrotiterplatte ist eine meist aus Kunststoff bestehende Platte mit mehreren Vertiefungen, die als Reaktions- und Messgefäße dienen. Sie wird für eine Vielzahl unterschiedlicher analytischer und diagnostischer Laboruntersuchungen eingesetzt und ist in verschiedenen Formaten mit unterschiedlicher Anzahl an Vertiefungen erhältlich.
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