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Mit technischer Innovation zur besseren Diagnostik

Der quantitative Nachweis von DNA-Strangbrüchen ist für viele Bereiche der biomedizinischen Forschung und Diagnostik von großer Bedeutung. Mithilfe des "Fluorescence-detected Alkaline DNA Unwinding"-Assays (FADU) können die Mechanismen der DNA-Schädigung und -Reparatur über den Nachweis von DNA-Strangbrüchen untersucht werden. Durch Automatisierung und weitere Optimierung haben Professor Alexander Bürkle und sein Team an der Uni Konstanz den FADU-Assay so weit verbessert, dass er effizienter und schneller durchgeführt werden kann. Das kommt bereits dem aktuell laufenden EU-Großprojekt MARK-AGE zugute, bei welchem Biomarker der Alterung beim Menschen an Tausenden von Blutproben erhoben werden. Außerdem hat das optimierte Verfahren das Potenzial, die Anzahl der Tierversuche zu reduzieren.

Prof. Dr. Alexander Bürkle, Dr. María Moreno-Villanueva von der Universität Konstanz © Universität Konstanz

Die heute üblichen Methoden zur Untersuchung von DNA-Strangbrüchen, beispielsweise die "alkalische Elution" oder der "Comet Assay", sind sehr zeit- und arbeitsintensiv, da sie zum Teil per Hand ausgeführt werden müssen. Auch der ursprüngliche FADU-Assay reiht sich in die Liste der aufwändigen Testverfahren ein. "Mir wurde bei meinen eigenen, ziemlich frustrierend verlaufenen Versuchen mit dem manuellen FADU-Assay schnell klar, dass dieses empfindliche Messverfahren nur in einer automatisierten Version eine breitere Nutzung finden wird", beschreibt Professor Bürkle seine Motivation zur Assay-Optimierung. Der Assay umfasst mehrere Pipettierschritte, die mit großer Präzision und z.T. sehr langsamer Geschwindigkeit (z.B. verwirbelungsfreies Aufeinanderschichten von zwei Flüssigkeitsphasen) bei weitgehender Abdunkelung und exakter Steuerung der Umgebungstemperatur durchgeführt werden müssen. "Dies ist bei manueller Durchführung zwar prinzipiell möglich, aber sehr zeitaufwändig, mühevoll und nur mit einer kleinen Probenzahl befriedigend durchführbar", beschreibt der Biologe die Nachteile.

Effizienter und schneller dank Optimierung

Die Funktionsweise des manuellen FADU-Assays gleicht im Wesentlichen der des automatisierten Assays. Zunächst wird die Zelllyse durchgeführt, anschließend erfolgt das verwirbelungsfreie Aufschichten einer alkalischen Lösung, was nach Diffusion in die Lysat-Phase zur allmählich fortschreitenden Entwindung der doppelstrangigen DNA führt; ausgehend von Chromosomenenden und internen DNA-Brüchen. Im nächsten Schritt wird eine Neutralisierungslösung zugegeben, was den Entwindungsprozess stoppt und quasi „einfriert“. Schließlich wird ein Fluoreszenzfarbstoff hinzugefügt, welcher selektiv die Quantifizierung der noch verbliebenen doppelstrangigen DNA ermöglicht. "Durch Mitführen diverser Kontrollen kann direkt auf die Anzahl von DNA-Strangbrüchen zum Zeitpunkt der Zelllyse rückgeschlossen werden", resümiert Bürkle.

Ressourcenschonung und Zeitgewinn standen im Zentrum seines Vorhabens zur Optimierung des FADU-Assays. Diese Ziele konnten er und sein Team mit Hilfe der Automatisierung erreichen. So haben die Konstanzer Forscher zunächst mithilfe eines Pipettierroboters und etlicher weiterer, von den wissenschaftlichen Werkstätten der Universität speziell angefertigter Geräteteile das Verfahren weitgehend automatisiert sowie den Assay miniaturisiert und - dank der Automatisierung - hochdurchsatzfähig gemacht. An die Stelle der manuellen Durchführung der einzelnen Pipettierschritte ist der Roboter getreten. "Der Bedarf an Zellmaterial, welches für den Assay bereitgestellt werden muss, konnte stark reduziert werden. Außerdem findet der Assay im Mikrotiterplatten-Format statt", beschreibt Bürkle die Vorteile der durchgeführten Modifizierung.

Zu den wesentlichen Vorteilen gegenüber dem üblichen "Comet-Assay" gehören die weitgehende Automatisierung und damit auch die Reduktion des Personalbedarfs, der stark erhöhte Probendurchsatz und die massive Zeitersparnis für die Durchführung des Messzyklus, welcher auf vier bis fünf Stunden reduziert werden konnte. "Am wichtigsten ist jedoch die standardisierte und objektive - weil maschinelle - Ablesung der Messergebnisse", so Professor Bürkle.

Die Einsatzgebiete sind vielseitig

Pipettierroboter mit Versuchsaufbau für den FADU-Assay © Universität Konstanz

Dank der Optimierung durch das Bürkle-Team ist der FADU-Assay flexibler und vielseitig einsetzbar, beispielsweise im Bereich der Grundlagenforschung von DNA-Schädigung und DNA-Reparatur. Darüber hinaus ist er gerade auch für Routinemessungen an einer großen Zahl von Messproben nützlich. „Hier denken wir vor allem an epidemiologische Studien mit großen Probandenzahlen, bei denen DNA-Schädigung und -Reparatur erfasst werden sollen“, erklärt Bürkle. Dies würde ihm zufolge bereits im derzeit laufenden EU-Großprojekt MARK-AGE zum Tragen kommen, bei welchem Biomarker der Alterung beim Menschen an Tausenden von Blutproben von Probanden erhoben werden sollen. Der automatisierte FADU-Assay könnte auch in Zukunft beim Durchmustern von chemischen Substanzen auf DNA-schädigende oder DNA-Reparatur beeinflussende Wirkung Verwendung finden. Hier werden geeignete Test-Zellen (Tumorzelllinien oder primäre Zellen, wie z.B. Leukozyten oder Fibroblasten) in vitro mit den zu testenden Substanzen bzw. Strahlen behandelt. Falls dies direkt in den Zellen zu DNA-Strangbrüchen führt, bzw. falls im Zuge der zellulären DNA-Reparaturaktivität DNA-Strangbrüche temporär entstehen, können diese nach dem oben erwähnten Prinzip nachgewiesen werden.

Ursula M. Händel-Tierschutzpreis: Verfahren hat das Potenzial, die Anzahl der Tierversuche zu reduzieren

Durch die neue Methode könnte auch die Anzahl von Tierversuchen reduziert werden, da direkt menschliche Zellen untersucht werden können. Im Gegensatz dazu wird die Testung auf krebserzeugende Substanzen bislang an Nagetieren durchgeführt. Diese Tests weisen zudem eine hohe Rate an falsch-positiven Ergebnissen auf: Der untersuchte Stoff wird fälschlicherweise als karzinogen eingestuft. Dank der neuen Vorgehensweise besteht nun die Hoffnung, dass diese Rate gesenkt werden kann und außerdem durch das nicht aufwändige Vortesten „in vitro“ die Anzahl der Versuchstiere insgesamt vermindert werden kann. Für diese Fortschritte wurde Professor Bürkle und seiner Mitarbeiterin Dr. María Moreno-Villanueva kürzlich der Ursula M. Händel-Tierschutzpreis der Deutschen Forschungsgesellschaft verliehen. Für die Konstanzer Forscher sind die Optimierungsarbeiten damit jedoch noch nicht beendet: „Die FADU-Maschine, die zur Zeit noch im Stadium eines Laborprototyps ist, soll in Zusammenarbeit mit externen Partnern zur Serienreife gebracht werden“, blickt Professor Alexander Bürkle in die Zukunft.

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