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Auf dem Weg zum Gentest für Zuhause

Heutzutage ist man schon in der Lage, eine Vielzahl an Gegebenheiten und Veränderungen in den Genen von Mensch, Tier und Pflanze, aber auch von Krankheitserregern nachzuweisen. Dies spielt vor allem in der Medizin für den Nachweis von Erkrankungen und der Möglichkeit, diese möglichst rasch gezielt therapieren zu können, eine große Rolle. Bislang braucht man für solche Tests jedoch spezielle Laborausstattungen, was den Einsatz direkt beim Patienten oder an abgelegenen Orten meist unmöglich macht. Nun haben Chemiker an der Universität Konstanz einen Gennachweis entwickelt, der ohne Laborumgebung durchgeführt und mit bloßem Auge ähnlich wie ein Schwangerschaftstest ausgewertet werden kann. Dieser Test würde sich deshalb für einfache Vor-Ort-Schnelltests eignen.

Für die Untersuchung von DNA- und RNA-Sequenzen gibt es heute schon viele verschiedene, zum Teil äußerst leistungsfähige Methoden, die die Basenabfolge direkt oder indirekt identifizieren. Die meisten dieser Methoden basieren darauf, dass der zu untersuchende Nukleinsäureabschnitt in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) zunächst einmal exakt kopiert wird. Um dies durchführen zu können, braucht man neben der entsprechenden Expertise jedoch auch die geeignete Laborausstattung an Geräten und Chemikalien. Zu den wichtigsten und empfindlichsten dieser Chemikalien gehören neben Nukleotiden, den Bausteinen für die neue Nukleinsäure, auch Enzyme – die Polymerasen. Diese sind auch in jeder lebenden Zelle zu finden. Sie lesen als molekulare Kopiermaschinen die entsprechende DNA oder RNA exakt ab und bauen den neuen Strang zusammen.

Glossar

  • Eine Base ist ein Bestandteil von Nukleinsäuren. Es gibt vier verschiedene Basen: Adenin, Guanin (Purinabkömmlinge), Cytosin und Thymin bzw. Uracil (Pyrimidinabkömmlinge). In der RNA ersetzt Uracil Thymin.
  • Biotechnologie ist die Lehre aller Verfahren, die lebende Zellen oder Enzyme zur Stoffumwandlung und Stoffproduktion nutzen.
  • Eine Chimäre ist ein genetisches Mosaik-Lebewesen, das aus der Verschmelzung von Embryonalzellen zweier verschiedener Arten hervorgeht (z. B. die „Schiege“ aus Schaf und Ziege, oder die „Tomoffel“ aus Tomate und Kartoffel).
  • Desoxyribonukleinsäure (DNS / DNA) trägt die genetische Information. In den Chromosomen liegt sie als hochkondensiertes, fadenförmiges Molekül vor.
  • Enzyme sind Katalysatoren in der lebenden Zelle. Sie ermöglichen den Ablauf der chemischen Reaktionen des Stoffwechsels bei Körpertemperatur.
  • Ein Gen ist ein Teil der Erbinformation, der für die Ausprägung eines Merkmals verantwortlich ist. Es handelt sich hierbei um einen Abschnitt auf der DNA, der die genetische Information zur Synthese eines Proteins oder einer funktionellen RNA (z. B. tRNA) enthält.
  • Nukleotide sind die Bausteine der Nukleinsäuren. Sie setzen sich aus einer Base, einem Zuckerrest und drei Phosphatgruppen zusammen. Bei der DNA- bzw. RNA-Synthese werden Nukleotide miteinander über eine Phosphordiesterbindung verknüpft. Dabei werden zwei Phosphatgruppen abgespalten.
  • Die PCR oder Polymerase-Kettenreaktion ist eine molekularbiologische Methode, mit der kurze DNA-Abschnitte auf einfache Weise vervielfältigt werden. Man benötigt dazu lediglich die DNA-Vorlage, ein Enzym namens DNA-Polymerase, das die Vervielfältigung katalysiert, Ansatzstücke für die Polymerase, die sog. Primer, und die DNA-Bausteine, die sog. Desoxynukleosidtriphosphate. Gesteuert wird die Vervielfältigung über mehrere Zyklen von Temperaturerhöhungen und -senkungen.
  • Proteine (oder auch Eiweiße) sind hochmolekulare Verbindung aus Aminosäuren. Sie übernehmen vielfältige Funktionen in der Zelle und stellen mehr als 50 % der organischen Masse.
  • Die Ribonukleinsäure (Abk. RNS oder RNA) ist eine in der Regel einzelsträngige Nukleinsäure, die der DNA sehr ähnlich ist. Sie besteht ebenfalls aus einem Zuckerphosphat-Rückgrat sowie einer Abfolge von vier Basen. Allerdings handelt es sich beim Zuckermolekül um Ribose und anstelle von Thymin enthält die RNA die Base Uracil. Die RNA hat vielfältige Formen und Funktionen; sie dient z. B. als Informationsvorlage bei der Proteinbiosynthese und bildet das Genom von RNA-Viren.
  • Nukleotidsequenzen sind Abfolgen der Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin auf der DNA (bzw. Uracil statt Thymin bei RNA).
  • Eine Sonde im molecularbiologischen Sinn ist ein Stück markierte RNA oder DNA, die mit einer gesuchten Sequenz binden (hybridisieren) kann.
  • Ein Virus ist ein infektiöses Partikel (keine Zelle!), das aus einer Proteinhülle und aus einem Genom (DNA oder RNA) besteht. Um sich vermehren zu können, ist es vollständig auf die Stoffwechsel der lebenden Zellen des Wirtsorganismus angewiesen (z.B. Bakterien bei Phagen, Leberzellen beim Hepatitis-A-Virus).
  • Die Molekularbiologie beschäftigt sich mit der Struktur, Biosynthese und Funktion von DNA und RNA und und deren Interaktion miteinander und mit Proteinen. Mit Hilfe von molekularbiologischen Daten ist es zum Beispiel möglich, die Ursache von Krankheiten besser zu verstehen und die Wirkungsweise von Medikamenten zu optimieren.
  • Eine Punktmutation ist eine Genmutation bei der nur wenige oder ein einzelnes Basenpaar betroffen sind.
  • Ein Polymer ist eine aus gleichartigen Einheiten aufgebaute kettenartige oder verzweigte chemische Verbindung. Die meisten Kunststoffe sind Polymere auf Kohlenstoffbasis.
  • Als Primer wird eine kurze Nukleotidsequenz bezeichent, die als Ausgangspunkt für die DNA-Replikation durch die DNA-Polymerasen dient.

Gentest mit dem bloßen Auge

Am Lehrstuhl für Zelluläre und Organische Chemie der Universität Konstanz experimentiert Prof. Dr. Andreas Marx mit seinem Forscherteam schon lange mit den „Kopiermaschinen für Nukleinsäuren“, den Polymerasen. Charakteristisch für diese Enzymklasse ist unter anderem, dass sie jeden Baustein für den neu entstehenden Nukleinsäurestrang exakt identifizieren und auswählen; sie akzeptieren allerdings unter Umständen auch leicht veränderte Nukleotide. Diese Möglichkeit wird in der Biotechnologie schon genutzt, um beispielsweise Markierungen anzubringen. Nun ist es den Konstanzer Chemikern gelungen, auch sehr große Modifikationen in einen neu synthetisierten DNA-Strang einzuschleusen: Sie stellten der Polymerase hierfür Nukleotide zur Verfügung, an die zuvor ein Protein gehängt wurde, das mehr als hundertmal größer war als das Nukleotid selbst, und mit dessen Hilfe eine einfache Farbreaktion in Gang gesetzt werden kann.

Die AG Marx beschäftigt sich an der Universität Konstanz unter anderem mit molekularen Kopiermaschinen – den Polymerasen. © Universität Konstanz

„Wir arbeiten schon über Jahre hinweg mit den Polymerasen“, erklärt Marx, „und haben versucht, schon die verschiedensten Moleküle an Nukleotide zu hängen, die von ganz normalen Standard-Polymerasen umgesetzt werden. Was man angehängt hat, ist dann mit der Zeit immer größer geworden – und es hat tatsächlich funktioniert.“ So entwickelten die Wissenschaftler nun ein Verfahren, in dem die Polymerase auch solche Nukleotide in den neuen Nukleinsäurestrang einbaut, die mit einer chemisch modifizierten Meerrettichperoxidase verlinkt wurden – einem relativ großen Protein aus Meerrettich1. Die einzige Voraussetzung, dass die Polymerase den modifizierten Baustein auch fehlerfrei einbaue, sei, dass ein Mindestabstand zwischen den Molekülen durch ein Verbindungsstück gesichert werde, wie der Chemiker sagt. Ihre Entdeckung haben die Konstanzer Wissenschaftler zum Patent angemeldet.

Polymerase arbeitet auch bei Raumtemperatur

Die Reaktion an sich läuft dabei im Prinzip ganz genauso ab wie mit unmodifizierten Nukleotiden: Die DNA wird vervielfältigt, indem die Polymerase den Einzelstrang abliest und dann das komplementäre Gegenstück Nukleotid für Nukleotid zusammenbaut. Bislang war in den Tests der Konstanzer Chemiker jeweils eines der zur Verfügung gestellten Nukleotide modifiziert. Dabei wurde das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer bestimmten Sequenz getestet. Hierfür wurden die gesuchten Sequenzen als kurze Segmente (Primer) auf einem Träger fixiert und dann die Nukleinsäureprobe und die entsprechenden Chemikalien zugegeben. War der gesuchte Abschnitt in der Probe vorhanden, synthetisierte die Polymerase den neuen Nukleinsäurestrang und baute dabei neben den Standard-Nukleotiden auch Hybride aus Nukleotid und Meerrettichperoxidase ein. Diese konnten dann anschließend mit einem simplen Test nachgewiesen werden, indem man ein zunächst farbloses Reagenz zugab, das von der Meerrettichperoxidase innerhalb von einer Minute zu einem rotbraunen Farbstoff umgesetzt wurde.

Farbreaktion beim Gennachweis mit Hilfe der Meerrettichperoxidase. © Universität Konstanz

Mithilfe der Methode konnten die Forscher aber nicht nur kurze Sequenzen nachweisen, sondern es gelang ihnen auch eine gezielte Suche nach Punktmutationen: Hierfür müssen die Primer so ausgewählt werden, dass sie direkt vor der relevanten Stelle enden. Die Nukleinsäureprobe bindet dann zwar, Nukleotid-Enzym-Hybride werden jedoch nur angehängt, wenn die Probe an dieser Stelle die gesuchte Base enthält. Zudem konnte mit einer anderen Polymerase spezifische virale RNA nachgewiesen werden – eine Methode, mit deren Hilfe Krankheitserreger identifiziert werden können.

Die Polymerasen, die Marx und seine Mitarbeiter für den Test einsetzen, sind so stabil, dass sie bei Raumtemperatur arbeiten. Dies ist bislang bei anderen molekularbiologischen Anwendungen nicht selbstverständlich: Die eigentlich temperaturempfindlichen Enzyme müssen in der Regel bei Gefrierschranktemperatur gelagert werden und benötigen Temperaturen über 50 °C, um nennenswert aktiv zu werden. „Wir haben eine Möglichkeit gefunden, wie man Polymerasen gefriertrocknet, ohne dass sie ihre Aktivität einbüßen. Als nächstes wollen wir sie auf Filterpapier fixieren“, berichtet der Professor. „In dieser Form sind sie sehr haltbar und beständig, und die Reaktion kann direkt dort stattfinden. Das Ergebnis kann man dann mit dem bloßen Auge ablesen – das könnte ganz ähnlich funktionieren wie bei einem Schwangerschaftstest.“ So kann auf aufwendige Laborausstattungen wie Thermocycler verzichtet und die Untersuchung praktisch überall durchgeführt werden. Lediglich für die exakte Quantifizierung der Nukleinsäuren bräuchte man ein Spektrometer.

Test-Prototypen für Ebola, Influenza und mehr

"Das einzige Problem, das wir aber noch haben, ist die Sensitivität“, sagt Marx. „Denn idealerweise soll der Test ja mit nur ein paar Tropfen Blut auskommen, aber das schaffen wir im Moment noch nicht, und das wird auch noch ein weiter Weg bis dahin.“ Deshalb wird derzeit in Konstanz damit experimentiert, wie Enzyme und Farbreaktion noch weiter optimiert werden können. Darüber hinaus werden der Professor und sein Team in den nächsten Wochen damit beschäftigt sein, Anträge zu schreiben, um die Technik bis zu konkreten Anwendungen weiterentwickeln zu können. „Was wir hierfür brauchen, ist viel Unterstützung, um einen Test-Prototypen herstellen zu können“, sagt er. Angedacht ist beispielsweise ein Schnelltest zur Identifizierung des Ebolavirus: „Bisher läuft das ja so, dass man eine Probe nimmt und diese dann durch unwegsames Gelände bis zum nächsten Labor transportieren muss, um dort die PCR zu machen. Mit dem Schnelltest könnte man das direkt vor Ort beim Patienten machen.“ Gleiches gilt für andere Krankheitserreger wie die Noro- oder Influenzaviren. Auch verschiedene Tests für Nahrungsmittel würden die Chemiker gerne anbieten: zum Beispiel, um Schweine- oder Pferdefleisch in Rindfleisch nachzuweisen, oder um schon lange vor der Ernte untersuchen zu können, ob Obstbäume mit schädlichen Erregern infiziert sind. Marx würde solche Tests gerne so weit bringen, dass sie praktisch von jedermann angewendet werden könnten: „Patienten könnten dann den Test, den sie vom Arzt bekommen haben, selbst problemlos zu Hause durchführen. Das ist unsere Vision.“

Literatur

1 Welter M, Verga D, Marx A. Sequence-Specific Incorporation of Enzyme-Nucleotide Chimera by DNA Polymerases. Angew Chem Int Ed Engl. 2016 Jul 8. DOI: 10.1002/anie.201604641

Seiten-Adresse: https://www.gesundheitsindustrie-bw.de/de/fachbeitrag/aktuell/auf-dem-weg-zum-gentest-fuer-zuhause/