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Designer-Proteine für pharmazeutische und biotechnologische Anwendungen

Proteine stellen den Grundbaustein aller Zellen im Organismus dar. Ihre biologische Aktivität üben die Eiweiße meist nicht als isolierte Einheit, sondern erst in Verbindung mit vielen anderen Proteinen aus. In unserem Körper spielen solche Proteinkomplexe bei vielen lebenswichtigen Prozessen eine Schlüsselrolle. In der Medizin werden Proteine etwa als Antikörper in der Impfstoffentwicklung benötigt. Eine der größten Herausforderungen der heutigen Zeit ist es, neuartige Impfstoffe gegen Krebserkrankungen zu entwickeln. Ein internationales Team in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Stefan Bräse am KIT hat mit dem innovativen MultiBacTAG-System eine Möglichkeit entwickelt, maßgeschneiderte Proteine für biotechnologische und pharmazeutische Anwendungen zu erzeugen.

Prof. Dr. Stefan Bräse und sein Team (im Bild mit seiner Mitarbeiterin Mirella Wawryszyn) forschen am KIT an der Entwicklung von Proteinen nach Maß. © privat

Alle Lebewesen besitzen in ihren Zellen ein Erbgut, die DNA, als Bauplan für den ganzen Organismus. Bestimmte DNA-Abschnitte stellen Bauanleitungen für bestimmte Proteine dar. Proteine-Komplexe selbst sind die „Maschinerie“, welche die Codierung der genetischen Information in Proteine ermöglicht. Die entstandenen Proteine ihrerseits haben vielfältige Aufgaben: Sie katalysieren wichtige zelluläre Funktionen, transportieren Stoffe, bauen als Enzyme Stoffe im Körper um oder ab, pumpen Ionen und erkennen Signalmoleküle. Eine besonders wichtige Funktion von Eiweißkomplexen ist es, neue Zellen aufzubauen und bestehende Zellen zu reparieren.

Die Gesamtheit der in einer bestimmten Zelle zu einer bestimmten Zeit vorhandenen Eiweißmoleküle, das Proteom, steht in einem Gleichgewicht zwischen Neusynthese und Abbau von Proteinen und ist damit fortlaufenden Änderungen in seiner Zusammensetzung unterworfen. Diese Änderungen werden über komplexe Regulationsvorgänge gesteuert, in die Wirkstoffe und Medikamente eingreifen können. „Hier eröffnet sich eine große Perspektive für Medizin und Life Sciences“, so Bräse vom Institut für Organische Chemie am KIT, der auf umfassende und internationale Forschungstätigkeiten in der angewandten Chemie sowie auf renommierte Auszeichnungen wie den ORCHEM-Preis für Nachwuchswissenschaftler und den Richard-Zsigmondy-Preis zurückblicken kann.

Glossar

  • Antikörper sind körpereigene Proteine (Immunglobuline), die im Verlauf einer Immunantwort von den B-Lymphozyten gebildet werden. Sie erkennen in den Körper eingedrungene Fremdstoffe (z. B. Bakterien) und helfen im Rahmen einer umfassenden Immunantwort, diese zu bekämpfen.
  • Bakterien sind mikroskopisch kleine, einzellige Lebewesen, die zu den Prokaryoten gehören.
  • Biotechnologie ist die Lehre aller Verfahren, die lebende Zellen oder Enzyme zur Stoffumwandlung und Stoffproduktion nutzen.
  • Desoxyribonukleinsäure (DNS / DNA) trägt die genetische Information. In den Chromosomen liegt sie als hochkondensiertes, fadenförmiges Molekül vor.
  • Enzyme sind Katalysatoren in der lebenden Zelle. Sie ermöglichen den Ablauf der chemischen Reaktionen des Stoffwechsels bei Körpertemperatur.
  • Escherichia coli (Abk.: E. coli) ist ein Colibakterium, das im menschlichen Darm vorkommt. Varianten dieses Colibakteriums (E. coli K12), denen bestimmte, für das Überleben in freier Wildbahn notwendige Eigenschaften des Wildtypbakteriums fehlen, werden in der Gentechnik häufig als so genannter Empfängerorganismus für die Klonierung von rekombinanten DNA-Stücken eingesetzt.
  • Eukaryonten sind Organismen, deren Zellen einen Zellkern und Organellen besitzen. Zu den Eukaryonten gehören Protozoen (Einzeller), Algen, Pilze, Pflanzen und Tiere (einschließlich Mensch).
  • Ein Expressionsvektor ist eine Genfähre, mit der man ein Gen für ein bestimmtes Protein in eine Wirtszelle (z.B. E. coli, Hefezellen) einschleusen kann. Außerdem ermöglicht der Expressionsvektor die Umsetzung des Gens in das Protein in der Wirtszelle, da er alle nötigen Regulationselemente hierfür enthält.
  • Ein Gen ist ein Teil der Erbinformation, der für die Ausprägung eines Merkmals verantwortlich ist. Es handelt sich hierbei um einen Abschnitt auf der DNA, der die genetische Information zur Synthese eines Proteins oder einer funktionellen RNA (z. B. tRNA) enthält.
  • Der genetische Code legt die Zuordnung der 64 Codons der DNA bzw. der mRNA zu den 20 Aminosäuren und 3 Stopcodons fest.
  • Das Genom ist die gesamte Erbsubstanz eines Organismus. Jede Zelle eines Organismus verfügt in Ihrem Zellkern über die komplette Erbinformation.
  • Gentechnik ist ein Sammelbegriff für verschiedene molekularbiologische Techniken. Sie ermöglicht, DNA-Stücke unterschiedlicher Herkunft neu zu kombinieren, in geeigneten Wirtszellen zu vermehren und zu exprimieren.
  • Aufgabe der Life Sciences ist die Erforschung, Entwicklung und Vermarktung von Produkten, Technologien und Dienstleistungen auf Basis der modernen Biotechnologie.
  • Für den Begriff Organismus gibt es zwei Definitionen: a) Jede biologische Einheit, die fähig ist, sich zu vermehren und selbstständig, d. h. ohne fremde Hilfe, zu existieren (Mikroorganismen, Pilze, Pflanzen, Tiere einschließlich Mensch). b) Legaldefinition aus dem Gentechnikgesetz: „Jede biologische Einheit, die fähig ist, sich zu vermehren oder genetisches Material zu übertragen.“ Diese Definition erfasst auch Viren und Viroide. Folglich fallen gentechnische Arbeiten mit diesen Partikeln unter die Bestimmungen des Gentechnikgesetzes.
  • Proteine (oder auch Eiweiße) sind hochmolekulare Verbindung aus Aminosäuren. Sie übernehmen vielfältige Funktionen in der Zelle und stellen mehr als 50 % der organischen Masse.
  • Die Rekombination ist der Vorgang, bei dem DNA neu kombiniert wird. Als natürlicher Prozess findet Rekombination bei der geschlechtlichen Vermehrung während der Meiose statt. Bei der In-vitro-Rekombination werden mit Hilfe molekulargenetischer Methoden DNA-Abschnitte unterschiedlicher Herkunft miteinander verknüpft.
  • Die Ribonukleinsäure (Abk. RNS oder RNA) ist eine in der Regel einzelsträngige Nukleinsäure, die der DNA sehr ähnlich ist. Sie besteht ebenfalls aus einem Zuckerphosphat-Rückgrat sowie einer Abfolge von vier Basen. Allerdings handelt es sich beim Zuckermolekül um Ribose und anstelle von Thymin enthält die RNA die Base Uracil. Die RNA hat vielfältige Formen und Funktionen; sie dient z. B. als Informationsvorlage bei der Proteinbiosynthese und bildet das Genom von RNA-Viren.
  • Das Proteom ist die Gesamtheit aller zu einem bestimmten Zeitpunkt unter definierten Bedingungen vorhandenen Proteine in einem Lebewesen, einem Gewebe oder einer Zelle.
  • Die Molekularbiologie beschäftigt sich mit der Struktur, Biosynthese und Funktion von DNA und RNA und und deren Interaktion miteinander und mit Proteinen. Mit Hilfe von molekularbiologischen Daten ist es zum Beispiel möglich, die Ursache von Krankheiten besser zu verstehen und die Wirkungsweise von Medikamenten zu optimieren.
  • Die Expression ist die Biosynthese eines Genprodukts (= Umsetzung der genetischen Information in Proteine). Sie erfolgt in der Regel als Transkription von DNA zu mRNA und anschließender Translation von mRNA zu Protein.
  • kb ist die Abkürzung für Kilobase. Diese Einheit für die Länge von DNA- oder RNA-Molekülen entspricht 1.000 Basen bzw. Basenpaaren der Nukleinsäure.
  • Molekular bedeutet: auf Ebene der Moleküle.
  • Triacylglyceride (auch Triglyceride genannt) ist die chemische Sammelbezeichnung für Fette und fette Öle. Sie sind wasserunlöslich.
  • Glykosilierung ist das Anbringen von Zuckerstrukturen an Proteinen, bspw. zur Erhöhung der Stabilität eines Proteins.
  • Als Fluoreszenz wird die spontane Emission von Licht bestimmter Wellenlänge nach Anregung eines Moleküls mit Licht einer anderen Wellenlänge bezeichnet.

Produktion rekombinanter Proteine hat großen Einfluss auf die Life-Science-Forschung

Dr. Edward A. Lemke, Gruppenleiter für Hochauflösende Untersuchungen am EMBL (Europäisches Labor für Molekularbiologie) in Heidelberg, ist zusammen mit einem internationalen Team an der Entwicklung des neuartigen MultiBacTAG-Systems beteiligt. © privat

Zellen können mithilfe von Proteinkomplexen Gene „lesen“ und daraufhin die entsprechenden Proteine bilden. Weil die Sprache der Gene universell ist, können auch ein Bakterium, eine Hefezelle oder Säugerzellen ein menschliches Gen lesen und daraufhin ein menschliches Protein bilden. Dazu wird in der Gentechnik das entsprechende menschliche Gen, das vorher isoliert, kopiert und vervielfältigt wurde, in die Produktionszellen eingebracht. Außerdem ist es möglich, Gene gezielt zu verändern oder sie aus Teilen mehrerer verschiedener Gene zusammenzusetzen. Diese rekombinanten Proteine finden als „Designer-Proteine“ in der Forschung und der Medizin Einsatz. Sie sind der Eckpfeiler zur Gewinnung zielgerichteter Proteinkomplexe wie Impfstoffe oder multiple Signalkaskaden-Proteine. Als Produktionsorganismen werden Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzellen verwendet.

Bakterienzellen wie E. coli haben zwar den Vorteil einer einfachen Kultivierung und guten Proteinausbeute, jedoch sind ihnen bezüglich der Biosynthese von Designer-Proteinen Grenzen gesetzt. Die meisten entstandenen Protein-Wirkstoffe benötigen für ihre Wirksamkeit eine Modifikation, zum Beispiel eine Glykosylierung, also ein Anhängen eines Zuckerrests, was nur mit Säugerzellen gelingt.

„Seit einigen Jahren arbeiten wir intensiv am „MultiBac-System“, dem Expressionsvektorsytem des Bacoluvirus, zur Produktion von eukaryontischen Proteinkomplexen“. Prof. Bräse arbeitet auf diesem Gebiet mit Dr. Edward A. Lemke, Gruppenleiter für Hochauflösende Untersuchungen am EMBL (Europäisches Labor für Molekularbiologie) in Heidelberg, in einem internationalen Team zusammen. Um die Information über die rekombinanten Proteine in eine Zelle zu übertragen, die das gewünschte Genprodukt dann in großen Mengen aus dem Gen exprimiert, wird ein Transportvehikel, eine Art „Genfähre“, benötigt. Erst die Weiterentwicklung des MultiBacTM-Expressionssystems aus Baculovirus als Genfähre und die Kombination mit den Insektenzellen Sf21 als Expressionsmaschinerie machen dies möglich.

Anwenderfreundlich und perspektivenreich – die Maschinerie aus MultiBac-System mit genetischer Code-Erweiterung und Insektenzell-Expression

Christine Koehler, Wissenschaftlerin am EMBL in Heidelberg, Arbeitsgruppe Prof. Dr. Lemke. © privat

Das MultiBac-System wurde speziell auf die Herstellung von eukaryontischen Proteinkomplexen, die viele Untereinheiten enthalten, zugeschnitten. Das System, das alle Einzelschritte ab Einsetzen der Gene in ein konstruiertes Baculovirus-Genom bis zur Proteinproduktion in Insektenzellen und Analyse des Proteins in Standardprotokollen dokumentiert umfasst, wurde am Swiss Federal Institute of Technology ETH (Zürich) von Imre Berger entwickelt und als Open-Access-Plattform am EMBL Grenoble weitergeführt. Die Plattform unterstützt viele Wissenschaftler aus Hochschule und Industrie, um Proteinkomplex-Forschungsprojekte zu beschleunigen.

Eine genetische Code-Erweiterung erlaubt es, eine nicht-kanonische Aminosäure in das gewünschte Protein (Protein of interest, POI) an eine bestimmte Stelle einzubauen. Nicht-kanonische Aminosäuren enthalten eine in der Natur nicht vorkommende, veränderte Seitengruppe (z. B. ein Cycloocten). Für die genetische Code-Erweiterung wird meist das Stopcodon TAG in das Gen des POI an die gewünschte Position eingebracht. Mithilfe eines speziellen tRNA/tRNA-Synthetase-Paares kann nun das gewünschte Protein mit der seitenspezifischen Modifikation, also unter Verwendung der unnatürlichen nicht-kanonischen Aminosäure, exprimiert werden. Dazu wird zuvor das tRNA/tRNA-Synthetase-Paar, das selektiv die nicht-kanonische Aminosäure erkennt, in die DNA des Baculovirus transferiert.

Durch die Kombination des MultiBac-Systems mit der genetischen Code-Erweiterung und mit dem speziell designten tRNA/tRNA-Synthetase-Paar ist es dem internationalen Team gelungen, Proteinkomplexe in Insektenzellen herzustellen, die unnatürliche Aminosäuren tragen. „Dies erlaubt eine Vielzahl von Anwendungen“, so Bräse. Seit Oktober 2016 ist das sogenannte MultiBacTAG-System erhältlich. Eine Publikation darüber ist in der renommierten Fachzeitschrift Nature Methods erschienen1. „MultiBacTAG ist nicht zuletzt durch die gute Dokumentation der einzelnen Arbeitsschritte nutzerfreundlich. Da die Komponenten der Gencode-Veränderung in die Struktur von MultiBacTAG eingesetzt sind, können Anwender unsere Erweiterung ohne vorherige Erfahrung oder Kenntnisse direkt verwenden“, stellt Bräse die Vorzüge heraus. Das System kann für die akademische Nutzung kostenlos erworben werden. Investoren können sich bei EMBLEM melden, dem Technologietransfer-Partner des EMBL. „Wir sind in der Lage, durch eine Kombination des MultiBac-Systems mit seitenspezifischen gentechnischen Methoden, dem MultiBacTAG, gewünschte Proteine mit eingebauten Zielfunktionalitäten in großen Mengen herzustellen“, so Bräse.

Die Anwendung des MultiBacTAG-Systems reicht von Fluoreszenz-Markierung spezifischer Zielstrukturen (zur Diagnostik) bis zur Erzeugung von pharmazeutischen Wirkstoffen. So konnten die chemischen Biologen beispielsweise Herceptin herstellen, ein Protein, das als Antikörper bei Brustkrebserkrankungen Anwendung findet. „MultiBacTAG eröffnet eine breite Palette an Möglichkeiten für das individuelle Proteindesign in biotechnologischen und pharmazeutischen Anwendungen. Die Erforschung von Proteinkomplexen und deren funktionellen Wechselwirkungen kann davon profitieren“, erklärt Bräse die zukunftsträchtigen Perspektiven.

Literatur:

1 Koehler C, Sauter PF, Wawryszyn M, Girona GE, Gupta K, Landry JJ, Fritz MH, Radic K, Hoffmann JE, Chen ZA, Zou J, Tan PS, Galik B, Junttila S, Stolt-Bergner P, Pruneri G, Gyenesei A, Schultz C, Biskup MB, Besir H, Benes V, Rappsilber J, Jechlinger M, Korbel JO, Berger I, Braese S, Lemke EA. (2016). Genetic code expansion for multiprotein complex engineering. Nat. Methods doi: 10.1038/nmeth.4032

Seiten-Adresse: https://www.gesundheitsindustrie-bw.de/de/fachbeitrag/aktuell/designer-proteine-fuer-pharmazeutische-und-biotechnologische-anwendungen/