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Ein RNA-Schalter für Proteinmutationen

Die RNA ist ein vielseitiges Molekül, das nicht nur zur Informationsweitergabe dient, sondern auch ebenso wie Enzyme chemische Reaktionen katalysieren kann. Solche Ribozyme (von Ribonukleinsäure und Enzym) sorgen beispielsweise im Ribosom für die Verknüpfung der Aminosäuren bei der Proteinbiosynthese. Professor Jörg Hartig von der Universität Konstanz hat nun eine neue Ribozym-basierte Methode entwickelt, um den Einbau von Aminosäuren bei der Translation durch RNA-Schalter, sogenannte „Riboswitches“ zu kontrollieren. Diese bieten einige Vorteile gegenüber klassischen Methoden zur Genregulation.

Prof. Jörg Hartig von der Universität Konstanz hat ein neues „RNA-Werkzeug“ entwickelt, mit dem die Genexpression auf der Ebene der Translation verändert werden kann. © Universität Konstanz

Bei der Charakterisierung von Proteinen werden oft Protein-Mutanten erzeugt, um die Rolle einzelner Aminosäuren für die Funktion des ganzen Proteins zu untersuchen. Dazu muss für jede Protein-Variante jeweils eine passende Mutation erzeugt und in den Modellorganismus eingebracht werden. So war es zumindest bisher meist der Fall. Doch es scheint auch einfacher zu gehen, wie Jörg Hartig, Professor für Biopolymerchemie an der Universität Konstanz gezeigt hat.

Er hat einen RNA-basierten „Werkzeugkasten“ entwickelt, um beim ribosomalen Einbau eine Aminosäure durch eine andere auszutauschen und so die Protein-Zusammensetzung auf post-transkriptionaler Ebene zu beeinflussen. Bei den dafür eingesetzten „Werkzeugen“ handelt es sich um Riboswitches, die die Genexpression auf der Ebene der Translation kontrollieren können. „Das sind RNA-Schalter der Genexpression, die Proteinmutationen ohne Veränderungen des Genotyps einführen können“, erklärt Hartig.

Riboswitches sind RNA-Sequenzabschnitte, die direkt vor dem translatierten Bereich der mRNA liegen und die selbst nicht translatiert werden. Natürlicherweise kommen sie fast ausschließlich bei Bakterien vor und sind generell aus zwei Teilen aufgebaut: der Aptamer-Domäne und der Expressionsplattform. Bei der Aptamer-Domäne handelt es sich um einen kurzen RNA-Abschnitt, der eine spezielle 3D-Struktur ausbilden und dadurch ein spezifisches Zielmolekül, beispielsweise Tetracyclin binden kann. Durch die Bindung an dieses Zielmolekül verändert sich die Faltung der Aptamer-Domäne, wodurch auch die Expressionsplattform beeinflusst wird. Diese bewirkt in der Folge die Änderung der Genexpression. So kann beispielsweise durch eine Konformationsänderung der Expressionsplattform die Ribosomen-Bindestelle verdeckt werden, wodurch die Translation des Gens verhindert wird.

Designer-tRNA als Schlüssel zum Austausch der Aminosäuren

Jörg Hartig und seine Arbeitsgruppe haben sich aber ein noch ausgeklügelteres System ausgedacht und das Prinzip auf die t-RNA übertragen: „Wir haben das Ribozym mit der tRNA in einer Weise verknüpft, welche die normalerweise eingenommene Faltung der tRNA stört und so die Verwendung der tRNA hemmt“, erläutert Hartig. Induziert man nun den Riboswitch und damit die Spaltung der tRNA, schneidet sich das Ribozym von der tRNA, welche dann entsprechend ihrer Funktion in der Translation verwendet wird. „Durch die Zugabe eines kleinen Effektor-Moleküls zum Wachstumsmedium wird diese tRNA also eingeschaltet“, schildert er weiter.

Bei den kontrollierten tRNAs handelt es sich um sogenannte amber Suppressor-tRNAs. Diese besitzen eine Mutation in der Anticodon-Schleife, die dazu führt, dass ein amber Stoppcodon (UAG) in der RNA bei der Translation unterdrückt und stattdessen zum Einbau einer Aminosäure benutzt wird. „Mit unseren tRNA-Schaltern können wir dann kontrollieren, ob die Translation am Stoppcodon abbricht oder mit der gewünschten Aminosäure fortgesetzt wird“, verdeutlicht Hartig die Funktionsweise des Systems. Die mRNA wird also je nach tRNA unterschiedlich gelesen und der gezielte Einbau einer bestimmten Aminosäure an dieser Position wird möglich.

Zur Schaltung des Aminosäureeinbaus benötigt man für E. coli nur ein auf einem Plasmid eingebrachtes tRNA-Schaltsystem, welches aus Aptamer, Ribozym und Amber-Suppressor-tRNA zusammengesetzt ist. Setzt man dabei mehrere tRNA-Schaltsysteme parallel ein, die jeweils eine andere Aptamer-Domäne aufweisen, können also durch die Zugabe verschiedener Effektormoleküle auch verschiedene tRNAs geschalten werden. Dadurch ist auch der gezielte Einbau verschiedener Aminosäuren möglich. „So können unterschiedliche Proteine synthetisiert werden, indem wir variierende Kombinationen von Effektormolekülen einsetzen: Zugabe von Effektor 1 ermöglicht Einbau von Aminosäure 1, Zugabe von Effektor 2 entsprechend Aminosäure 2, bei Zugabe von beiden Effektoren erhält man eine Mischung von Proteinvarianten“, erklärt der Biochemiker das System. Gibt man dagegen keinen der Effektoren zu, so erhält man ein verkürztes Protein, da die Translation am ersten Stoppcodon abbricht.

Schema zur posttranskriptionalen Erzeugung von Proteinvarianten durch die Kontrolle von Designer-tRNAs mittels RNA-Schalter. © Hartig

Anwendungsmöglichkeiten von Proteindesign bis zur Virus-Kontrolle

Generell sind RNA-Schalter nicht nur für biotechnologische Anwendungen und die Synthetische Biologie interessant, um beispielsweise gezielt Proteine zu designen. Durch sie werden auch ganz neue Möglichkeiten zur Genregulation in Systemen eröffnet, in denen konventionelle Ansätze nicht ausreichend funktionieren.

Ein Beispiel ist der Einsatz zur Kontrolle der Genexpression in onkolytischen Viren, die gezielt Tumor-Zellen befallen und töten. Eine effiziente Kontrolle der Genexpression in solch maßgeschneiderten Viren ist aus Sicherheitsgründen unerlässlich. Allerdings versagen klassische Systeme oft, da sich die Stöchiometrie zwischen benötigten Transkriptionsfaktoren und den Zielsequenzen im viralen Erbgut während der viralen Replikationszyklen stark ändert. Bei den Riboswitches ergibt sich dieses Hindernis nicht, da sie Teil der entsprechenden mRNA sind und somit jede abzulesende RNA-Botschaft auch einen Schalter zum Ein- oder Ausschalten mitbringt. „In einer Kooperation mit Dirk Nettelbeck vom DKFZ Heidelberg konnten wir zeigen, dass sich unsere RNA-Schalter sehr gut für diese Anwendung eignen“, berichtet Hartig (BIOPRO-Beitrag: „Viren mit eingebautem Gen-Schalter“).

Nach Einschätzung des Forschers sollte der Ansatz mit jedem Protein funktionieren, wenn auch je nach Sequenzkontext unterschiedlich effizient. Aktuell arbeitet seine Gruppe außerdem an der Übertragung des Prinzips in Eukaryonten. „Wir sind optimistisch, mit unseren Schaltern und dem zugrundeliegenden System den Aminosäureeinbau in Zukunft auch in höheren Organismen steuern zu können“, prognostiziert Hartig hoffnungsvoll.

Glossar

  • Aminosäuren sind die Bausteine der Proteine; es gibt insgesamt 20 verschiedene Aminosäuren in Proteinen.
  • Bakterien sind mikroskopisch kleine, einzellige Lebewesen, die zu den Prokaryoten gehören.
  • Biotechnologie ist die Lehre aller Verfahren, die lebende Zellen oder Enzyme zur Stoffumwandlung und Stoffproduktion nutzen.
  • Enzyme sind Katalysatoren in der lebenden Zelle. Sie ermöglichen den Ablauf der chemischen Reaktionen des Stoffwechsels bei Körpertemperatur.
  • Escherichia coli (Abk.: E. coli) ist ein Colibakterium, das im menschlichen Darm vorkommt. Varianten dieses Colibakteriums (E. coli K12), denen bestimmte, für das Überleben in freier Wildbahn notwendige Eigenschaften des Wildtypbakteriums fehlen, werden in der Gentechnik häufig als so genannter Empfängerorganismus für die Klonierung von rekombinanten DNA-Stücken eingesetzt.
  • Eukaryonten sind Organismen, deren Zellen einen Zellkern und Organellen besitzen. Zu den Eukaryonten gehören Protozoen (Einzeller), Algen, Pilze, Pflanzen und Tiere (einschließlich Mensch).
  • Ein Gen ist ein Teil der Erbinformation, der für die Ausprägung eines Merkmals verantwortlich ist. Es handelt sich hierbei um einen Abschnitt auf der DNA, der die genetische Information zur Synthese eines Proteins oder einer funktionellen RNA (z. B. tRNA) enthält.
  • Genexpression ist der Begriff für die Biosynthese eines Genprodukts (= Umsetzung der genetischen Information in Proteine). Sie erfolgt in der Regel als Transkription von DNA zu mRNA und anschließender Translation von mRNA zu Protein.
  • Lytisch zu sein ist die Eigenschaft eines Bakteriophagen, seine Wirtszelle bei der Infektion zu zerstören.
  • Mit dem Begriff Mutation wird jede Veränderung des Erbguts bezeichnet (z. B. Austausch einer Base; Umstellung einzelner DNA-Abschnitte, Einfügung zusätzlicher Basen, Verlust von Basen oder ganzen DNA-Abschnitten). Mutationen kommen ständig in der Natur vor (z. B. ausgelöst durch UV-Strahlen, natürliche Radioaktivität) und sind die Grundlage der Evolution.
  • Für den Begriff Organismus gibt es zwei Definitionen: a) Jede biologische Einheit, die fähig ist, sich zu vermehren und selbstständig, d. h. ohne fremde Hilfe, zu existieren (Mikroorganismen, Pilze, Pflanzen, Tiere einschließlich Mensch). b) Legaldefinition aus dem Gentechnikgesetz: „Jede biologische Einheit, die fähig ist, sich zu vermehren oder genetisches Material zu übertragen.“ Diese Definition erfasst auch Viren und Viroide. Folglich fallen gentechnische Arbeiten mit diesen Partikeln unter die Bestimmungen des Gentechnikgesetzes.
  • Ein Plasmid ist ein extrachromosomales, ringförmiges DNA-Molekül, das bei Bakterien und Hefen vorkommt und sich unabhängig vom Hauptchromosom vermehren kann. Häufig tragen Plasmide Gene für Resistenzfaktoren (z. B. gegen Antibiotika), die den Trägern einen Selektionsvorteil vermitteln. Wenn die Gegenwart eines Plasmids für ein Bakterium keinen Überlebensvorteil bietet, dann verliert es dieses mit der Zeit. Plasmide mit Transfergenen können von einem Bakterium auf ein anderes übertragen werden.
  • Die Proteinbiosynthese ist die zelluläre Synthese von Proteinen. Sie besteht aus zwei Schritten: Die Transkription, d.h. das Anfertigen einer mRNA-Kopie des jeweiligen DNA-Abschnitts und der Translation, d.h. das Übersetzen der Basenabfolge auf der RNA in Aminosäuresequenzen des Proteins.
  • Proteine (oder auch Eiweiße) sind hochmolekulare Verbindung aus Aminosäuren. Sie übernehmen vielfältige Funktionen in der Zelle und stellen mehr als 50 % der organischen Masse.
  • Replikation ist der biologische Fachbegriff für die Verdoppelung der DNA-Doppelhelix.
  • Die Ribonukleinsäure (Abk. RNS oder RNA) ist eine in der Regel einzelsträngige Nukleinsäure, die der DNA sehr ähnlich ist. Sie besteht ebenfalls aus einem Zuckerphosphat-Rückgrat sowie einer Abfolge von vier Basen. Allerdings handelt es sich beim Zuckermolekül um Ribose und anstelle von Thymin enthält die RNA die Base Uracil. Die RNA hat vielfältige Formen und Funktionen; sie dient z. B. als Informationsvorlage bei der Proteinbiosynthese und bildet das Genom von RNA-Viren.
  • Das Ribosom ist Protein-Nukleinsäurekomplex zur Proteinbiosynthese unter Verwendung von mRNA als Vorlage.
  • Die Ribonukleinsäure (Abk. RNS oder RNA) ist eine in der Regel einzelsträngige Nukleinsäure, die der DNA sehr ähnlich ist. Sie besteht ebenfalls aus einem Zuckerphosphat-Rückgrat sowie einer Abfolge von vier Basen. Allerdings handelt es sich beim Zuckermolekül um Ribose und anstelle von Thymin enthält die RNA die Base Uracil. Die RNA hat vielfältige Formen und Funktionen; sie dient z. B. als Informationsvorlage bei der Proteinbiosynthese und bildet das Genom von RNA-Viren.
  • Nukleotidsequenzen sind Abfolgen der Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin auf der DNA (bzw. Uracil statt Thymin bei RNA).
  • Als Stoppcodons werden drei der 64 Codons (UAG, UAA und UGA) aus der mRNA bezeichnet, die zum Kettenabbruch bei der Proteinbiosynthese führen und somit das Ende des Synthesevorgangs signalisieren.
  • Tetracyclin ist ein Breitband-Antibiotikum das von der Gattung Streptomyces produziert wird und die prokaryotische Proteinbiosynthese hemmt.
  • Mit Transkription im biologischen Sinn ist der Vorgang der Umschreibung von DNA in RNA gemeint. Dabei wird mithilfe eines Enzyms, der RNA-Polymerase, ein einzelsträngiges RNA-Molekül nach der Vorlage der doppelsträngigen DNA synthetisiert.
  • Translation im biologischen Sinn ist der Prozess, bei dem die Basensequenz der mRNA in die Aminosäuresequenz des Proteins übersetzt (translatiert) wird. Dieser Vorgang findet an den Ribosomen statt. Nach der Vorlage eines einzigen mRNA-Moleküls können zahlreiche Proteinmoleküle synthetisiert werde
  • Die Transfer-RNA (t-RNA) ist eine RNA mit L-förmiger Raumstruktur, die in der Translationsphase der Proteinbiosynthese (Übersetzung des RNA-Codes in eine Aminosäuresequenz) als Adaptermolekül dient. Jede t-RNA verfügt dazu einerseits über eine Bindestelle für eine spezifische Aminosäure und andererseits über ein spezifisches Basentriplett, das sog. Anticodon, das komplementäre Codons auf der m-RNA erkennen und binden kann. Dadurch wird der Einbau der jeweils richtigen Aminosäure in das entstehende Protein sichergestellt.
  • Ein Virus ist ein infektiöses Partikel (keine Zelle!), das aus einer Proteinhülle und aus einem Genom (DNA oder RNA) besteht. Um sich vermehren zu können, ist es vollständig auf die Stoffwechsel der lebenden Zellen des Wirtsorganismus angewiesen (z.B. Bakterien bei Phagen, Leberzellen beim Hepatitis-A-Virus).
  • Ein Transkriptionsfaktor ist ein Protein, dass die Herstellung einer RNA-Kopie eines Gens (Transkription) steuert. Transkriptionsfaktoren binden an bestimmte Sequenzen auf der DNA und interagieren mit der RNA-Polymerase, die dadurch ihre Transkriptionsaktivität verändert.
  • Ein Tumor ist eine Gewebsschwellung durch abnormales Zellwachstum, die gutartig oder bösartig sein kann. Gutartige (benigne) Tumore sind örtlich begrenzt, während Zellen bösartiger (maligner) Tumore abgesiedelt werden können und in andere Gewebe eindringen können, wo sie Tochtergeschwulste (Metastasen) verursachen.
  • Biochemie ist die Lehre von den chemischen Vorgängen in Lebewesen und liegt damit im Grenzbereich zwischen Chemie, Biologie und Physiologie.
  • Die Expression ist die Biosynthese eines Genprodukts (= Umsetzung der genetischen Information in Proteine). Sie erfolgt in der Regel als Transkription von DNA zu mRNA und anschließender Translation von mRNA zu Protein.
  • Der Genotyp (Erbbild) repräsentiert die genetische Ausstattung eines Organismus.
  • Messenger-RNA (Abk.: mRNA) ist eine Ribonukleinsäure, die eine Kopie eines kurzen DNA-Stücks darstellt und als Vorlage für die Synthese eines spezifischen Proteins dient.
  • Als Target (engl.:Ziel) werden Biomoleküle bezeichnet, an die Wirkstoffe binden können. Targets können Rezeptoren, Enzyme oder Ionenkanäle sein. Die Interaktion zwischen Wirkstoff und Target löst eine Wirkstoff-Target-spezifische Reaktion aus. Die Identifikation eines Targets ist für die biomedizinische und pharmazeutische Forschung von großer Bedeutung. Erkenntnisse über spezifische Wechselwirkungen helfen grundlegende molekularbiologische Vorgänge zu verstehen und neue Angriffpunkte für Arzneimittel zu identifizieren.
  • Eine Proteindomäne ist ein konservierter, strukturell abgegrenzter Bereich innerhalb der Polypeptidkette eines Proteins, der eine bestimmte Faltstruktur aufweist und dadurch meist auch eine individuelle Funktion besitzt. Proteine besitzen häufig mehrerer solcher Domänen, die in ihrer Gesamtheit die spezifische Funktion des Proteins bestimmen.
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