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Epigenetik

Lesedomänen spüren Histonveränderungen auf

Gene können durch chemische Modifikationen der DNA oder der Histon-Proteine an- und abgeschaltet und dadurch reguliert werden. Folglich haben solche Veränderungen eine herausragende Funktion für jeden gesunden Organismus, und ihre Untersuchung spielt deshalb sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der klinischen Forschung eine große Rolle. Bisher wurden sie meist mithilfe von Antikörpern in speziellen biochemischen Tests nachgewiesen, was aber Nachteile hat. Prof. Dr. Albert Jeltsch vom Institut für Biochemie der Universität Stuttgart hat nun mit seinem Forscherteam eine alternative Methode vorgestellt, mit deren Hilfe Änderungen von Histonmodifikationen erkannt werden können. Hierfür werden Teile natürlicher Proteine – sogenannte Lesedomänen – einsetzt. Damit sollen die Tests in Zukunft einfacher, preiswerter und die experimentellen Daten reproduzierbarer werden.

Glossar

  • Antikörper sind körpereigene Proteine (Immunglobuline), die im Verlauf einer Immunantwort von den B-Lymphozyten gebildet werden. Sie erkennen in den Körper eingedrungene Fremdstoffe (z. B. Bakterien) und helfen im Rahmen einer umfassenden Immunantwort, diese zu bekämpfen.
  • Bakterien sind mikroskopisch kleine, einzellige Lebewesen, die zu den Prokaryoten gehören.
  • Desoxyribonukleinsäure (DNS / DNA) trägt die genetische Information. In den Chromosomen liegt sie als hochkondensiertes, fadenförmiges Molekül vor.
  • Enzyme sind Katalysatoren in der lebenden Zelle. Sie ermöglichen den Ablauf der chemischen Reaktionen des Stoffwechsels bei Körpertemperatur.
  • Escherichia coli (Abk.: E. coli) ist ein Colibakterium, das im menschlichen Darm vorkommt. Varianten dieses Colibakteriums (E. coli K12), denen bestimmte, für das Überleben in freier Wildbahn notwendige Eigenschaften des Wildtypbakteriums fehlen, werden in der Gentechnik häufig als so genannter Empfängerorganismus für die Klonierung von rekombinanten DNA-Stücken eingesetzt.
  • Ein Expressionsvektor ist eine Genfähre, mit der man ein Gen für ein bestimmtes Protein in eine Wirtszelle (z.B. E. coli, Hefezellen) einschleusen kann. Außerdem ermöglicht der Expressionsvektor die Umsetzung des Gens in das Protein in der Wirtszelle, da er alle nötigen Regulationselemente hierfür enthält.
  • Ein Gen ist ein Teil der Erbinformation, der für die Ausprägung eines Merkmals verantwortlich ist. Es handelt sich hierbei um einen Abschnitt auf der DNA, der die genetische Information zur Synthese eines Proteins oder einer funktionellen RNA (z. B. tRNA) enthält.
  • Nukleinsäure ist der Oberbegriff für DNA und/oder RNA.
  • Für den Begriff Organismus gibt es zwei Definitionen: a) Jede biologische Einheit, die fähig ist, sich zu vermehren und selbstständig, d. h. ohne fremde Hilfe, zu existieren (Mikroorganismen, Pilze, Pflanzen, Tiere einschließlich Mensch). b) Legaldefinition aus dem Gentechnikgesetz: „Jede biologische Einheit, die fähig ist, sich zu vermehren oder genetisches Material zu übertragen.“ Diese Definition erfasst auch Viren und Viroide. Folglich fallen gentechnische Arbeiten mit diesen Partikeln unter die Bestimmungen des Gentechnikgesetzes.
  • Proteine (oder auch Eiweiße) sind hochmolekulare Verbindung aus Aminosäuren. Sie übernehmen vielfältige Funktionen in der Zelle und stellen mehr als 50 % der organischen Masse.
  • Ein Vektor ist ein DNA-Vehikel, das sich in einer Zelle autonom replizieren (vervielfältigen) kann und mit dessen Hilfe Fremd-DNA in eine Zelle eingeschleust wird. Vektoren (Plasmid, Phage oder Virus) sind wichtige Werkzeuge der Gentechnik zum Klonieren rekombinanter DNA.
  • Ein Tumor ist eine Gewebsschwellung durch abnormales Zellwachstum, die gutartig oder bösartig sein kann. Gutartige (benigne) Tumore sind örtlich begrenzt, während Zellen bösartiger (maligner) Tumore abgesiedelt werden können und in andere Gewebe eindringen können, wo sie Tochtergeschwulste (Metastasen) verursachen.
  • Biochemie ist die Lehre von den chemischen Vorgängen in Lebewesen und liegt damit im Grenzbereich zwischen Chemie, Biologie und Physiologie.
  • Eine Immunpräzipitation (IP) ist eine molekularbiologische Methode, mit der Wechselwirkungen zwischen Proteinen nachgewiesen werden. Dazu wird ein Antikörper verwendet (deswegen Immun-), mit dem ein Protein samt Interaktionspartner aus einem Proteingemisch durch Fällung (=Präzipitation) herausgefischt wird. Die beiden Interaktionspartner werden anschließend mittels Western Blot sichtbar gemacht.
  • Chromatin ist ein Komplex aus Proteinen und DNA, das in der Interphase der Mitose auftaucht. Es stellt die entspiralisierten Chromosomen dar.
  • Ein Nukleosom ist eine Verpackungseinheit innerhalb der Chromosomen, die aus Histonen und DNA bestehen.
  • Histone sind Eiweiße, die der geordneten Verpackung der DNA-Helix in Form von Chromosomen dienen. Dabei wird die lange DNA-Helix um die Histone herum gewunden. Diese Komplexe aus DNA und Histonen werden Nukleosomen genannt und bilden die Untereinheit der Chromosomen.
  • Die Epigenetik beschäftigt sich mit den vererbbare Veränderungen in der Genexpression, die nicht auf Abweichungen in der Sequenz der DNA zurückzuführen sind.
  • Methylgruppen sind Atomgruppierungen mit der Zusammensetzung -CH3.
  • Methylierung ist die Einführung von Methylgruppen in organische Verbindungen.
  • Methyltransferasen sind Enzyme, die eine Methylgruppe auf ihre Substrate übertragen, wie z.B. die DNA-Methyltransferase.
  • Ein Inkubator im biologischen bzw. medizinischen Sinne wird auch als Brutschrank oder Brutkasten bezeichnet. In einem Inkubator können gezielt optimale Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen für Brut- und Wachstumsvorgänge geschaffen werden. Im wirtschaftlichen Bereich bezeichnet der Begriff Einrichtungen und Institutionen, die junge Unternehmen bei der Existenzgründung unterstützen.
  • Eine Proteindomäne ist ein konservierter, strukturell abgegrenzter Bereich innerhalb der Polypeptidkette eines Proteins, der eine bestimmte Faltstruktur aufweist und dadurch meist auch eine individuelle Funktion besitzt. Proteine besitzen häufig mehrerer solcher Domänen, die in ihrer Gesamtheit die spezifische Funktion des Proteins bestimmen.

Die DNA ist im Zellkern an Histon-Proteine gebunden. Durch chemische Modifikationen wie Methylierung oder Acetylierung der Histon-Proteine oder Methylierung der DNA können Gene reguliert werden. Das heißt, Gene werden auf Basis solcher Modifikationen an- oder abgeschaltet, was essenziell für das intakte Funktionieren eines jeden Lebewesens ist. Abweichende Modifikationsmuster können zu Erkrankungen führen: Beispielsweise besitzen Tumorzellen häufig DNA-Methylierungsmuster, die sich von denjenigen gesunder Gewebe erheblich unterscheiden. Die Veränderungen an Nukleinsäure oder Protein können auch vererbt werden. Man bezeichnet das Phänomen als epigenetisch.

Prof. Dr. Albert Jeltsch ist Lehrstuhlinhaber am Institut für Biochemie der Universität Stuttgart. Er hat ein neues Verfahren vorgestellt, mit dem krankheitsverursachende Histonveränderungen zuverlässig erkannt werden können. © Jeltsch

Mit solchen epigenetischen Fragestellungen beschäftigt sich Prof. Dr. Albert Jeltsch, Lehrstuhlinhaber am Institut für Biochemie der Universität Stuttgart gemeinsam mit seinem Team schon lange: „Unsere Forschungsarbeiten drehen sich alle darum, wie Gene reguliert werden", so Jeltsch. Dabei untersuchen die Wissenschaftler die unterschiedlichsten Facetten epigenetischer Regulationsprozesse: beispielsweise wie Methyltransferasen – die Enzyme, die Methylgruppen an DNA oder Histone anfügen und damit Signale für die Genregulation setzen – arbeiten, wie sie selbst reguliert werden und wie das Methylierungsmuster entsteht.

Modifikationen bestimmen funktionelle Chromatinzustände

Ein weiteres großes Forschungsprojekt konzentriert sich auf die Frage, wie Histon-Modifikationen abgelesen werden: „Uns interessiert die Frage, wie die Zelle überhaupt merkt, dass ein Histon modifiziert wurde", erklärt der Professor. „Und wir wissen bereits, dass hierfür sogenannte Lesedomänen verantwortlich sind. Das sind Proteindomänen, die am Nukleosom binden, wenn dort eine bestimmte Modifikation vorliegt, und damit eine biologische Antwort auslösen, zum Beispiel ein Gen anschalten." Damit wird der funktionelle Zustand des Chromatins im Wesentlichen durch seine chemischen Modifikationen bestimmt. Eine Untersuchung dieser Modifikationen ist daher für die verschiedensten Fragestellungen wie beispielsweise der Charakterisierung von Tumoren außerordentlich wichtig.

Darstellung des Prinzips der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP): Mononukleosome werden für den Nachweis von Histonmodifikationen mit dem jeweiligen Antikörper inkubiert. © Jeltsch

Während für die Untersuchung von DNA-Modifikationen schon seit Jahren viele leistungsfähige Techniken existieren, ist das Methodenspektrum zur Analyse von Veränderungen an Histon-Proteinen noch relativ eng. Hier war bisher die Methode  der Wahl die sogenannte Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP), bei der das Chromatin in Mononukleosome zerlegt und mit den Antikörpern inkubiert wird, die Histone mit bestimmten definierten Modifikationen binden. „Auf der Antikörperspezifität für eine bestimmte Modifikation baut bis heute noch die gesamte Forschung eines Feldes auf", so Jeltsch. „Dabei gibt es aber oft Probleme, wie beispielsweise die Kreuzaktivität der Antikörper, wenn diese auch andere Modifikationen erkennen als sie sollen, oder falsch-negative Ergebnisse, wenn die korrekte Bindung eines Antikörpers beispielsweise durch Nachbarmodifikationen verhindert wird, obwohl die Zielmodifikation anwesend ist."

Antikörpertests häufig nicht reproduzierbar

Ein weiteres echtes Problem sei die Antikörperversorgung mit gleichbleibenden Eigenschaften, wie der Professor für Biochemie sagt: „Wenn der Antikörpervorrat leer ist, werden einfach neue gemacht, und die haben dann häufig in kritischen Details andere Eigenschaften, sodass die Experimente im Prinzip nicht reproduzierbar sind." Und er fügt noch hinzu: „Die Qualität ändert sich fast mit jedem Batch, und aufgrund der aufwendigen Produktionsverfahren ist es für die Firmen nicht möglich, für gleichbleibende Eigenschaften zu sorgen. Das ist ein echtes wissenschaftlich-philosophisches Problem, da die langfristige Reproduzierbarkeit von Ergebnissen eine zentrale Forderung an gute wissenschaftliche Arbeit darstellt." Zudem ist die Produktion von Antikörpern aufwendig. Deshalb kamen die Forscher vom Stuttgarter Institut für Biochemie vor einigen Jahren auf die Idee, die Antikörper durch biologische Lesedomänen zu ersetzen.

Chromatin mit Modifikationen an DNA und Histonen und angelagerten Lesedomänen © EMBL-EBI

Solche Lesedomänen sind Teile natürlicher Proteine, die an das zu untersuchende, modifizierte Histon binden und dort nachgewiesen werden können. Sie können relativ einfach mit spezifischen Vektoren in E.-coli-Bakterien mit hoher Ausbeute – also vergleichsweise preiswert – produziert werden: „Wenn der Vektor einmal da ist, kann man das gewünschte Protein auch in 20 Jahren noch mit den immer gleichen Eigenschaften herstellen", wie Jeltsch sagt. „Damit garantiert unser Ansatz eine gleichbleibende Qualität der Reagenzien und damit Reproduzierbarkeit der Ergebnisse."

Der einzige Nachteil, den die Lesedomänen gegenüber den Antikörpern haben, ist die schwächere Bindungsaffinität, was aber kompensiert werden kann, indem man mehr Substrat einsetzt. Im Moment sieht Jeltsch in puncto Lesedomänen aber sonst keine technische Hürde: „Sie sind genauso gut wie Antikörper – ob man das immer verallgemeinern kann, wird die Zukunft zeigen. In jedem Fall wollen wir aber auch daran arbeiten, die Lesedomänen mithilfe des Proteindesigns noch weiter zu optimieren."

Geschäftsidee Lesedomänen

Da Lesedomänen im Reagenzglas auch über Jahre noch nachhaltig produziert werden können, wollen die Wissenschaftler das von ihnen erforschte Prinzip nun auch kommerziell nutzen. Im Moment läuft ein Patentantrag, der über die Universität Stuttgart finanziert wurde, und Jeltsch und Kollegen sind auf der Suche nach Kooperationspartnern: „Wir bemühen uns im Moment, einen Vertriebspartner für die Lesedomänen zu finden. Dann würden wir die Proteine produzieren und testen und sie dann dem Partner übergeben. Und natürlich auch weitere entwickeln – aber das ist jetzt noch eine Zukunftsvision." Die Produktion der Lesedomänen in Bakterien ist für den Laborgebrauch gut etabliert, eine Hochskalierung sollte keine Probleme machen, sagt der Professor.

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