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Neuartiger Biochip für Wirkstoffsuche bei neuronalen Erkrankungen

Parkinson, Alzheimer und Epilepsie sind drei prominente Beispiele für Erkrankungen des Nervensystems, bei denen intensiv nach neuen Wirkstoffen gesucht wird. Dr. Paolo Cesare vom NMI Reutlingen hat ein innovatives 3D-Testsystem für neuronale Wirkstoffe entwickelt, das ohne Tierversuche auskommt. 2015 wurde das MEAFLUIT-System preisgekrönt und erhielt den 1. Preis im Science2Start-Ideenwettbewerb der BioRegion STERN.

Dr. Paolo Cesare hat 1998 am renommierten King's College der Universität London über die Transformation von physikalischen und chemischen Stimuli in elektrische Signale bei der Schmerzentstehung promoviert. Danach hat er unter anderem neun Jahre an der Universität La Sapienza in Rom geforscht, bevor er zum NMI Reutlingen kam. © NMI Reutlingen

Ersatzmethoden für Tierversuche scheitern häufig an ihrer zu geringen Aussagekraft. Das gilt besonders, wenn Substanzen gesucht werden, die im Nervensystem wirken sollen, um beispielsweise die Leiden von Alzheimer- und Parkinson-Patienten zu lindern. Die äußerst komplexe neuronale Signalweiterleitung und -verarbeitung des Nervensystems lässt sich nicht mit einfachen Zellsystemen im Labor nachbilden. Dennoch sprechen nicht nur ethische Gründe für die Suche nach Alternativen, denn Tierversuche sind auch zeitraubend, kostenintensiv und nicht immer auf den Menschen übertragbar. Deshalb arbeiten Forscher weltweit intensiv daran, realistische Testszenarien und zuverlässige Labormethoden für die Wirkstofftestung zu entwickeln.

Das MEAFLUIT-System von Paolo Cesare vom NMI Reutlingen ist eine besonders aussichtsreiche, tierversuchsfreie Alternative, um die molekularen, zellulären sowie funktionellen Mechanismen bei neuronalen Erkrankungen zu untersuchen und Wirkstoffe dagegen zu testen. Cesare kombiniert auf einem Biochip Mikroelektroden-Arrays (MEAs) mit Mikrofluid-Systemen – eine Kombination, die es in dieser Art bisher nicht gab. Cesare erklärt das Prinzip: „Wir haben die Kompartimentierung von Nervenzellen auf den Biochip übertragen. Auf einem Chip sind mehrere Zellkulturkammern angeordnet, in denen Nervenzellen wachsen. Von diesen Kammern gehen sieben Mikrometer breite und fünf Mikrometer hohe Mikrokanäle aus. Neuriten, also die Ausläufer von Nervenzellen, können dort hindurchwachsen, während die Zellkörper aufgrund ihrer Abmessungen nicht hineinpassen. Auf diese Weise sind beide Kompartimente auf dem Chip physikalisch voneinander getrennt. In einer bestimmten Zone quer zu den Kanälen sind im Glasboden des Biochips Hunderte von Mikroelektroden eingebettet, über die elektrische Signale der Neuriten abgeleitet werden können und die Nervenzellen stimuliert werden können.“

Glossar

  • Ein Mikroelektroden-Array (MEA) ist ein spezieller Chip, der eine Vielzahl von Elektroden enthält und dessen Oberfläsche chemisch so beschaffen ist, dass Nervenzellen an definierten Stellen dort anwachsen können. So ist es möglich, ein geordnetes Netzwerk von Nervenzellen zu erschaffen, das durch die Elektroden elektrisch stimuliert wird und so als Modell für Vorgänge im Gehirn verwendet werden kann.
  • Mikrofluidik ist der Sammelbegriff für das Fließverhalten von Flüssigkeiten in Strukturen, deren Dimensionen im Mikrometerbereich liegen.
  • Neuron ist der Fachausdruck für Nervenzelle. Diese besteht aus einem Zellkörper, einem Axon und Dendriten.
  • Zellen, die fähig sind sich zu jedem anderen Zelltyp des Körpers zu differenzieren, werden als pluripotent bezeichnet. Anders als totipotente Zellen können sie aber keinen neuen Organismus bilden.
  • Stammzellen sind Zellen, die die Fähigkeit zur unbegrenzten Zellteilung besitzen und die sich zu verschiedenen Zelltypen ausdifferenzieren können. Stammzellen können aus Embryonen, fötalem Gewebe und aus dem Gewebe Erwachsener gewonnen werden. In Deutschland ist die Gewinnung embryonaler Stammzellen verboten.
  • Eine Zellkultur ist ein Pool von gleichartigen Zellen, die aus mehrzelligen Organismen isoliert wurden und in künstlichem Nährmedium für Forschungsexperimente im Labor (in vitro) gehalten werden.
  • Die Zelldifferenzierung bezeichnet die Spezialisierung von Zellen in Bezug auf ihre Funktion und ihre Struktur. So entstehen aus undifferenzierte Stammzellen verschiedene Zelltypen wie Herzmuskel-, Nerven- oder Leberzellen, die ganz unterschiedlich ausssehen und verschiedene Aufgaben erfüllen.
  • Synapsen sind die Kontaktstellen zwischen Nervenzellen untereinander bzw. Nervenzellen und anderen Zellen (z.B. Muskelzellen). In chemischen Synapsen wird ein ankommender elektrischer Impuls der Nervenzelle in ein chemisches Signal umgewandelt: Es werden sogenannte Neurotransmitter ausgeschüttet, die wiederum die Zielzelle zur Erzeugung eines elektrischen Impulses anregen.
  • Der postsynaptische Teil einer Synapse (Verbindungsstelle zwischen einer Nervenzelle und einer nachgeschalteten Zelle) ist der, der in Laufrichtung des Signals hinter dem synaptischen Spalt liegt.
  • Neurotransmitter sind biochemische Botenstoffe, die an der Synapse, der Kontaktstelle zwischen Nervenzelle und Zielzelle, ausgeschüttet werden und so für die Signalweiterleitung sorgen. Die Ausschüttung der Transmittermoleküle wird durch ankommende elektrische Impulse (Aktionspotenziale) in der Nervenzelle veranlasst. Die Neurotransmitter binden nach der Ausschüttung an spezifische Rezeptoren in der Membran der nachgeschalteten Zielzelle und lösen dadurch wiederum ein Aktionspotenzial aus.
  • Physiologie ist die Lehre von den biochemischen und physikalischen Vorgängen in Zellen, Geweben und Organen der Lebewesen.
  • Die Alzheimer-Krankheit (auch Morbus Alzheimer genannt) ist eine langsam fortschreitende Demenz-Erkrankung, die sich in einer immer stärkeren Abnahme der Hirnfunktionen äußert. Sie tritt vor allem im Alter auf. Die Hauptursache von Alzheimer sind intrazelluläre Ablagerungen eines Fragments des Amyloid-Vorläufer-Proteins (APP), wodurch es zu einem zunehmenden Verlust von Nervenzellen und damit der Gehirnmasse kommt. Die Betroffenen zeigen anfangs nur eine geringfügigen Vergesslichkeit. In späteren Stadien sind vor allem die Sprache, das Denkvermögen und das Gedächtnis beeinträchtigt. Im Endstadium der Krankheit kommt es schließlich zu einem vollständigen Verlust des Verstandes sowie der Persönlichkeit der betroffenen Personen.
  • Die Parkinson-Krankheit (auch: Morbus Parkinson) ist eine langsam fortschreitende degenerative Erkrankung des Gehirns. Ausgelöst wird sie durch das Absterben von Dopamin ausschüttenden Nervenzellen im Gehirn. Dadurch kommt es zu einem Mangel an Dopamin und zu einer verminderten Aktivität der sog. Basalganglien, die wichtig für die Kontrolle der Motorik sind. Die fortschreitende Störung der Motorik äußert sich in den typischen Parkinson-Symptomen Muskelstarre, Muskelzittern Bewegungsarmut, sowie Haltungsinstabilität.
  • Epilepsien sind Funktionsstörungen des Gehirns, bei denen es zu spontanen, unkontrollierten Entladungen der Nervenzellen kommt. Kontrollieren diese Nervenzellen Muskelkontraktionen, kommt es zu Krämpfe und damit zu unkoordinierten, schnellen Bewegungen, die der Epilepsiekranke nicht steuern kann. Sind Nervenzellen betroffen, die für das Denken und Bewusstsein eine Rolle spielen, verliert ein Betroffener bei einem Anfall das Bewusstein.
  • Ein Mikroelektroden-Array (MEA) ist ein spezieller Chip, der eine Vielzahl von Elektroden enthält und dessen Oberfläsche chemisch so beschaffen ist, dass Nervenzellen an definierten Stellen dort anwachsen können. So ist es möglich, ein geordnetes Netzwerk von Nervenzellen zu erschaffen, das durch die Elektroden elektrisch stimuliert wird und so als Modell für Vorgänge im Gehirn verwendet werden kann.
  • Bundesministerium für Bildung und Forschung

Synaptische Signalübertragung tierversuchsfrei und kontrolliert untersuchen

Schematische Darstellung des MEAFLUIT-Funktionsprinzips mit verschiedenen mikrofluidischen Kammern (rechts, links, Mitte), die über Mikrokanäle miteinander verbunden sind und damit eine funktionsgerichtete Kompartimentierung der Neurone ermöglichen. Die planaren Mikroelektroden (schwarz) dienen zur neuronalen Stimulation und Messung der neuronalen Aktivitäten entlang einer neuronalen Verschaltung. © Paolo Cesare, NMI Reutlingen

Bei Alzheimer, Parkinson und anderen neuronalen Erkrankungen ist an den synaptischen Verbindungen zwischen zwei Nervenzellen die Signal-Übertragung gestört. Wenn nun in Zellkammern rechts und links auf dem Chip Nervenzellen platziert sind, deren Neuriten jeweils in die verbindenden Mikrokanäle hineinwachsen, treffen sich die von links und rechts kommenden Fortsätze zwangsläufig in einer definierbaren Zone. Und genau hier kann die Signalweiterleitung dann untersucht werden – mit oder ohne Zugabe von Wirkstoffen ins Medium. „Wenn wir geringe Spannungen an die Mikroelektroden anlegen, können wir die Nervenzellen damit stimulieren. Die Auswirkung von Substanzen, die die Ausschüttung von Neurotransmittern in den synaptischen Spalt beeinflussen, kann damit ebenso getestet werden wie die Auswirkung von Substanzen, die die postsynaptische Weiterleitung beeinflussen. Wir messen die spezifischen Effekte auf synaptischer Ebene und können auf dem Biochip die Signalverarbeitung neuronaler Verschaltungen über lange Zeiträume hinweg messen“, sagt Cesare.

Die Nervenzellen, die Cesare für sein Testsystem verwendet, lassen sich relativ leicht aus menschlichen Stammzellen gewinnen, indem diese mittels iPS-Technologie (induzierte pluripotente Stammzellen) zu Nervenzellen differenziert werden. Zurzeit entwickelt er das MEAFLUIT-System in Kooperation mit der Industrie vor allem in Hinblick auf Wirkstoff-Tests für Alzheimer weiter. „Unternehmen haben in diesem Bereich eine hohe Nachfrage nach besseren Vorhersage-Systemen“, so Cesare. Ein großer Vorteil seines Testsystems ist auch der relativ hohe Durchsatz: Im nächsten Entwicklungsschritt enthält der Chip schon so viele Kammern, dass parallel vier getrennte Experimente auf einem Chip durchgeführt werden können. Und an einer höheren Kammerzahl pro Biochip arbeitet das Team bereits.

Auch die Forschung profitiert von der Neuentwicklung. Zum Beispiel können Nervenzellen kranker und gesunder Menschen hinsichtlich ihrer Signalverarbeitung verglichen werden. Das soll dazu beitragen, neuronale Funktionen noch besser zu erforschen und zu verstehen. In einem von der EU geförderten Projekt will Cesare den Chip so anpassen, dass damit das Nervenwachstum in 3D gemessen und auch visualisiert werden kann. Auch in der Schmerzforschung sieht Cesare Potenzial für das MEAFLUIT-System. Es können zum Beispiel Patientengruppen mit unterschiedlichen Schmerz-Ausprägungen untersucht werden, um neue Erkenntnisse über das Phänomen Schmerz zu erhalten. „Wir haben bereits erste Experimente gestartet, um neuronale Schmerz-Schaltkreise nachzubauen und die Schmerzverarbeitung damit zu erforschen“, so Cesare.

Der gesamte Chip in der Übersicht. Der zentrale Bereich innerhalb des schwarzen Quadrats entspricht dem in obiger Abbildung dargestellten Ausschnitt des MEAFLUIT-Chips. Die MEA-Elektroden sind der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt, wohl aber die Mikrokanäle (als grauer Blockstreifen). Über die runden Reservoirs am Anfang und Ende der Kulturkammern werden Zellen bzw. Wirkstoffe eingebracht. © Paolo Cesare, NMI Reutlingen

Medikamentenentwicklung kann ebenso profitieren wie die Forschung

Das hohe Potenzial sowohl für die kommerzielle Wirkstofftestung als auch für die Forschung überzeugte die Jury des Science2Start-Ideenwettbewerbs. Cesare gewann in der Ausschreibung 2015 den ersten Preis, der ihm auf dem Sommerempfang der BioRegion STERN im Juli 2015 feierlich überreicht wurde. Cesare arbeitet zurzeit weiter daran, sein System zur Marktreife zu bringen, wobei er die Forschung jedoch nicht aus dem Blick lässt. Aktuell hat er im Rahmen des BMBF-Programms „Alternativen zum Tierversuch“ ein Forschungsprojekt eingeworben, bei dem er zwar tierische Zellen in seinem MEAFLUIT-System einsetzt, diese jedoch wesentlich besser nutzen kann als in zweidimensionalen Zellkultur-Testsystemen bei gleichzeitig erhöhter Vorhersagekraft. „Wir kommen der natürlichen Physiologie damit einfach näher als mit herkömmlichen Testmethoden“, bringt Cesare es auf den Punkt.

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