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Neues Analyseverfahren zur Epigenetik – im Dienst des medizinischen Fortschritts

Nicht nur genetische Faktoren beeinflussen Entwicklungsvorgänge und Erkrankungen. Immer mehr zeigt sich auch die große Rolle epigenetischer Veränderungen. Dank einer neuen Methode der Universität Stuttgart können die Vorgänge nun erstmals kontinuierlich in der lebenden Zelle verfolgt werden.

Vieles wurde in den letzten Jahrzehnten herausgefunden über den Einfluss von Genen bzw. Genmutationen beim Entstehen und dem Verlauf von Krankheiten. Die DNA-Sequenz der Gene ist dabei jedoch nicht alles. Seit einigen Jahren sind die Forscher einem Aspekt auf der Spur, der größeren Einfluss auf die Genaktivitäten hat als ursprünglich angenommen. Ohne in die DNA-Sequenz und damit den Bauplan der Proteine einzugreifen, können die Basen der DNA chemisch modifiziert werden. Am häufigsten sind Methylierungen, etwa das Anfügen einer Methylgruppe an die Cytosinbase der DNA.

Prof. Dr. Albert Jeltsch leitet seit 2011 die Abteilung Biochemie an der Universität Stuttgart. © A. Jeltsch, IBTB, Uni Stuttgart

Solche gewissermaßen übergeordneten – epigenetischen – Veränderungen bestimmen ganz wesentlich mit, ob und in welchem Umfang Gene aktiviert oder stillgelegt werden. Manche DNA-Abschnitte werden regelrecht gespickt mit Methylgruppen, die zu charakteristischen Mustern führen. Dabei ist das Geschehen fließend, viele Faktoren und eben auch Krankheiten können die Methylierungsmuster beeinflussen. Und um das Ganze noch zu komplizieren, können auch Histone, die „Verpackungsproteine“ der DNA im Chromosom, methyliert werden, was ebenfalls die Genaktivität in der Umgebung beeinflussen kann.

Epigenetische Veränderungen und Einflüsse genauer zu untersuchen, ist daher ein wichtiges Forschungsziel. Gerade in Hinblick auf Erkrankungen an der Schnittstelle zwischen dem Genom und Umgebungseinflüssen – wie etwa Krebs. Dahinter steckt die Hoffnung, über gezielte Eingriffe in die epigenetischen Modifikationen neue therapeutische Ansätze zu finden. Bisher war es jedoch nicht möglich, das epigenetische Geschehen live – also in der lebenden Zelle – zu betrachten. Es fehlte schlicht an Methoden dafür.

Prof. Dr. Albert Jeltsch leitet die Abteilung Biochemie am Institut für Biochemie und Technische Biochemie an der Universität Stuttgart und hat mit seinem Team nun einen echten Meilenstein zur Erforschung epigenetischer Veränderungen geliefert. Durch Einsatz einer ausgetüftelten Fluoreszenz-Markierungs-Strategie können die Forscher nun über einen längeren Zeitraum von Tagen und Wochen hinweg epigenetische Prozesse gezielt verfolgen.

Glossar

  • Eine Base ist ein Bestandteil von Nukleinsäuren. Es gibt vier verschiedene Basen: Adenin, Guanin (Purinabkömmlinge), Cytosin und Thymin bzw. Uracil (Pyrimidinabkömmlinge). In der RNA ersetzt Uracil Thymin.
  • Chromosomen sind die unter dem Mikroskop sichtbaren Träger der Erbanlagen. Die Anzahl der im Zellkern vorhandenen Chromosomen ist artspezifisch. Beim Menschen sind es zweimal 23. Mit Ausnahme der Geschlechtschromosomen liegen Chromosomen in Körperzellen sowie in befruchteten Eizellen paarweise als sog. homologe Chromosomen vor. In den Keimzellen ist nach Abschluss der Reifungsteilungen nur ein einfacher Chromosomensatz vorhanden.
  • Cytosin (Abkürzung: C) ist ein Bestandteil (eine Base) der Nukleinsäuren und ein Pyrimidin-Abkömmling.
  • Desoxyribonukleinsäure (DNS / DNA) trägt die genetische Information. In den Chromosomen liegt sie als hochkondensiertes, fadenförmiges Molekül vor.
  • Ein Gen ist ein Teil der Erbinformation, der für die Ausprägung eines Merkmals verantwortlich ist. Es handelt sich hierbei um einen Abschnitt auf der DNA, der die genetische Information zur Synthese eines Proteins oder einer funktionellen RNA (z. B. tRNA) enthält.
  • Das Genom ist die gesamte Erbsubstanz eines Organismus. Jede Zelle eines Organismus verfügt in Ihrem Zellkern über die komplette Erbinformation.
  • Für den Begriff Organismus gibt es zwei Definitionen: a) Jede biologische Einheit, die fähig ist, sich zu vermehren und selbstständig, d. h. ohne fremde Hilfe, zu existieren (Mikroorganismen, Pilze, Pflanzen, Tiere einschließlich Mensch). b) Legaldefinition aus dem Gentechnikgesetz: „Jede biologische Einheit, die fähig ist, sich zu vermehren oder genetisches Material zu übertragen.“ Diese Definition erfasst auch Viren und Viroide. Folglich fallen gentechnische Arbeiten mit diesen Partikeln unter die Bestimmungen des Gentechnikgesetzes.
  • Proteine (oder auch Eiweiße) sind hochmolekulare Verbindung aus Aminosäuren. Sie übernehmen vielfältige Funktionen in der Zelle und stellen mehr als 50 % der organischen Masse.
  • Nukleotidsequenzen sind Abfolgen der Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin auf der DNA (bzw. Uracil statt Thymin bei RNA).
  • Ein Tumor ist eine Gewebsschwellung durch abnormales Zellwachstum, die gutartig oder bösartig sein kann. Gutartige (benigne) Tumore sind örtlich begrenzt, während Zellen bösartiger (maligner) Tumore abgesiedelt werden können und in andere Gewebe eindringen können, wo sie Tochtergeschwulste (Metastasen) verursachen.
  • Biochemie ist die Lehre von den chemischen Vorgängen in Lebewesen und liegt damit im Grenzbereich zwischen Chemie, Biologie und Physiologie.
  • kb ist die Abkürzung für Kilobase. Diese Einheit für die Länge von DNA- oder RNA-Molekülen entspricht 1.000 Basen bzw. Basenpaaren der Nukleinsäure.
  • Die Pathologie ist ein Teilgebiet der Medizin, das sich mit der Erforschung und Lehre von den Ursachen, der Entstehung, der Verlaufform und der Auswirkungen von krankhaften Symptomen sowie von Missbildungen beschäftigt.
  • Die Zytologie oder auch Zellbiologie ist eine Disziplin der Biowissenschaften, in der mit Hilfe mikroskopischer und molekularbiologischer Methoden die Zelle erforscht wird, um biologische Vorgänge auf zellulärer Ebene zu verstehen und aufzuklären.
  • Heterogenität bedeutet Ungleicheit bzw. Verschiedenheit in der Struktur.
  • Als Fluoreszenz wird die spontane Emission von Licht bestimmter Wellenlänge nach Anregung eines Moleküls mit Licht einer anderen Wellenlänge bezeichnet.
  • Chromatin ist ein Komplex aus Proteinen und DNA, das in der Interphase der Mitose auftaucht. Es stellt die entspiralisierten Chromosomen dar.
  • Histone sind Eiweiße, die der geordneten Verpackung der DNA-Helix in Form von Chromosomen dienen. Dabei wird die lange DNA-Helix um die Histone herum gewunden. Diese Komplexe aus DNA und Histonen werden Nukleosomen genannt und bilden die Untereinheit der Chromosomen.
  • Die Epigenetik beschäftigt sich mit den vererbbare Veränderungen in der Genexpression, die nicht auf Abweichungen in der Sequenz der DNA zurückzuführen sind.
  • Methylgruppen sind Atomgruppierungen mit der Zusammensetzung -CH3.
  • Methylierung ist die Einführung von Methylgruppen in organische Verbindungen.

Live dabei: den Fluss des epigenetischen Geschehens beobachten

Mithilfe des BiAD-Sensors werden methylierte DNA-Regionen (gelb) im Kern einer menschlichen Zelle sichtbar. Die Sensor-Komponenten sind links oben schematisch dargestellt. Blau markiert ist das Ankerprotein (Zinkfingerprotein), rot das Detektorprotein (MBD2-Protein); beide Proteine sind an Teile eines Fluorophors gekoppelt, die sich zu einem aktiven Fluorophor zusammenlagern können (grün). © A. Jeltsch, IBTB, Uni Stuttgart

„Mit der neuen Methode können wir dynamische epigenetische Prozesse während der zellulären Entwicklung beziehungsweise während pathologischer Veränderungen online verfolgen, und das gibt es so bisher nicht. Standardverfahren zur Analyse von DNA-Methylierung und Chromatin-Modifikationen sind diskontinuierliche Verfahren, mit denen wir nicht das Profil einer einzelnen Zelle erhalten, sondern eine heterogene Mischung von Zellen mit unterschiedlichen Methylierungsstadien, die wir nicht mit dem Phänotyp einer Zelle korrelieren können“, erklärt Jeltsch. Nun sind Fluoreszenzmarkierungen, auch bei lebenden Zellen, eigentlich nichts Neues, sondern gehören zum Standard-Repertoire der Forscher. Allerdings konnten mithilfe fluoreszenzmarkierter Proteine bisher keine epigenetischen Vorgänge einzelner Genorte analysiert werden.

„Das CRISPR/Cas-Verfahren hat einen wichtigen Durchbruch gebracht. Mit seiner Hilfe können wir unsere neue BiAD-Methode leicht an neue Genorte adressieren und dort die Methylierung untersuchen“, so Jeltsch. BiAD steht für „Bimolecular Anchor Detector“, ein raffiniertes Zwei-Komponenten-System. Hierzu wird in die Zelle das Gen für ein Ankerprotein mit zwei wesentlichen Eigenschaften eingebracht: Es bindet spezifisch an einen bestimmten Genort und es verfügt über ein Teilstück eines Fluorophors. Für sich allein kann dieses Teilstück kein Leuchtsignal aussenden, dafür muss es erst mit einem zweiten Teilstück fusionieren. Und dieses zweite Teilstück ist an ein Leseprotein gebunden, das typische methylierte Stellen der DNA erkennt und daran bindet. Nur wenn sich Leseprotein und Ankerprotein in unmittelbarer Nachbarschaft befinden – sprich, wenn das zu untersuchende Gen entsprechend methyliert ist –, können die Teilstücke zum fluoreszierenden Gesamtprotein fusionieren. Das Fluoreszenzsignal kann dann mikroskopisch detektiert werden. „Das Sensorsystem ist spezifisch, robust und modular, das heißt, mit verschiedenen Lesedomänen kombinierbar. Und es funktioniert im Prinzip mit allen Zelltypen“, fasst Jeltsch die wesentlichen Vorteile zusammen.

BiAD-Sensoren bestehen aus einer Ankerdomäne (orange), die DNA sequenzspezifisch bindet, und einer Lese- bzw. Detektordomäne (violett), die eine Chromatinmodifikation bindet. Beide Proteine sind an Teile eines Fluorophors (grau) gekoppelt, die sich zu einem aktiven Fluorophor (grün) zusammenlagern, wenn sie sich nahekommen. © A. Jeltsch, IBTB, Uni Stuttgart

Epigenetische Modifikationen könnten Schlüssel für neue Therapien liefern

Noch steht die Forschung mit BiAD ganz am Anfang. Jedoch zeichnen sich bereits einige hoch interessante Anwendungen ab. So ist bei Krebszellen zum Beispiel bekannt, dass bestimmte repetitive DNA-Elemente untermethyliert werden, während Tumorrepressorgene zunehmend methyliert und dadurch außer Gefecht gesetzt werden. Um hier die Zusammenhänge genauer zu untersuchen, könnten unterschiedliche Fluoreszenzen eingesetzt werden. Gen-reprimierende epigenetische Veränderungen könnten dann zum Beispiel grün fluoreszieren und aktivierende Veränderungen rot. Und es muss auch nicht immer nur um die DNA-Methylierung gehen. Das System kann auch für andere epigenetische Veränderungen angepasst werden, zum Beispiel solche, bei denen Chromatin-Strukturen acetyliert werden. Das Spiel der Möglichkeiten ist eröffnet und es sind viele Spielzüge denkbar.

Bei aller Euphorie müssen die Auswirkungen der Methode auf die Zelle jedoch noch näher untersucht werden, wie Jeltsch sagt: „Die Grundvoraussetzung für die Qualität der Analyse ist, dass die Zelle durch die Untersuchung nicht zu sehr gestört wird. Wir müssen zum Beispiel den Effekt auf die Chromatinstruktur noch näher untersuchen.“ Parallel dazu ist er mit seinem Team dabei, weitere Fluorophore mit noch stärkerer Leuchtkraft einzubauen. Zurzeit liegt die Detektionsgrenze bei 15 bis 25 Fluorophoren pro Genabschnitt, weshalb sich das Team bisher vor allem auf repetitive DNA-Elemente als Zielorte konzentriert hat. Da ist also noch Luft nach oben bis hin zum Einzelsignal. „In Kooperation mit dem Team um Prof. Dr. Monilola Olayioye vom Institut für Zellbiologie hier in Stuttgart wollen wir die Methode jetzt zur Single-Spot-Detektion weiterentwickeln“, bestätigt Jeltsch.

Langfristig ist es der große visionäre Ansatz, mittels BiAD entwicklungs- oder krankheitsbedingte Umprogrammierungen der epigenetischen Muster im lebenden Organismus zu entschlüsseln. Klinisch ließe sich die neue Analyse-Methode zum Beispiel im Tumormodell einsetzen, um zu klären, wie und wann sich abnormale epigenetische Muster im Tumorgewebe entwickeln. Noch weiter gedacht, böten solche Befunde dann Ansatzpunkte für neue Therapien, bei denen zum Beispiel Methylierungen und andere epigenetische Veränderungen des Chromatins gezielt verhindert oder gefördert werden.

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